Эндокринная офтальмопатия (ЭОП) — аутоиммунное заболевание орбиты, тесно связанное с аутоиммунной патологией щитовидной железы [1, 6, 10]. Известно, что тканями-мишенями при ЭОП являются экстраокулярные мышцы (ЭОМ), ретробульбарная клетчатка (РБК) и мышцы век [1, 5, 7—10]. Доказан аутоиммунный характер происходящих в ЭОМ и РБК процессов [6, 9]. Методами визуализации орбиты (КТ, МРТ) и разработанного стандартного прижизненного неинвазивного исследования слезной железы (СЖ) в пространственных режимах В и 3D нами было установлено, что у каждого третьего пациента с эндокринной офтальмопатией увеличена СЖ [2—4]. Четких данных о развитии аутоиммунного воспаления в ткани СЖ при эндокринной офтальмопатии в доступной литературе не представлено.

Цель работы — изучить патоморфологические изменения ткани СЖ при ЭОП.

Материалом для морфологических исследований служили интраоперационные биоптаты 15 увеличенных СЖ, полученных при декомпрессии орбиты пациентов с верифицированной ЭОП. Диагноз ЭОП устанавливали на основании клинических и рентгенологических признаков. Декомпрессию орбиты выполняли на неактивной стадии заболевания.

В качестве нормы служили аутопсийные биоптаты, полученные в первые 6 ч после exitus (n=7).

На первом этапе удаленные ткани подвергались обязательному гистоморфологическому исследованию с целью уточнения характера патоморфологических изменений в СЖ. С этой целью блок иссеченных тканей фиксировали в 10% формалине в течение 30 сут. Осмотр объекта исследования проводили после обезвоживания в спиртах восходящей концентрации. Блоки, содержащие ткань собственно СЖ и окружающие ткани, заливали в парафин по традиционной методике. Готовили по 10 срезов толщиной 4—7 мкм с каждого блока. Окрашивали гематоксилином и эозином. Просмотр препаратов и фоторегистрацию осуществляли под микроскопом Opthon с телевизионной приставкой при увеличении ×40, ×125, ×400.

На втором этапе анализировали специфические гистоморфологические характеристики всех тестируемых СЖ, при этом учитывались: дистрофические и дегенеративные изменения в тканях СЖ, степень ее васкуляризации и фиброза, наличие зон некроза и кровоизлияний в строме, а также на поверхности. Для количественной оценки степени фиброза и васкуляризации использовали специальную методику с введением индексов фиброза и васкуляризации.

При подсчете индекса фиброза производили серию снимков различных участков препаратов СЖ. С помощью программы Photoshop (инструмент «волшебная палочка») выделяли пиксели, составляющие изображение фиброзных прослоек в СЖ, и подсчитывали их количество (данные вносили в предварительную таблицу). Полученное значение делили на общее количество пикселей в анализируемом изображении и получали индекс фиброза для участка гистологического препарата, отображенного на снимке. Индекс фиброза тестируемой СЖ находили как среднее арифметическое всех промежуточных значений.

Аналогично для количественной оценки индекса васкуляризации производили серию снимков различных участков препаратов СЖ. С помощью программы Photoshop (инструмент «овальная область») выделяли пиксели, составляющие изображение просвета сосудов в СЖ, и подсчитывали их количество. Полученное значение делили на общее количество пикселей изображения. Таким образом получали индекс васкуляризации для участка гистологического препарата, отображенного на снимке. Результаты вносили в предварительную таблицу в столбец промежуточных индексов васкуляризации. Индекс васкуляризации тестируемой СЖ высчитывали как среднее арифметическое из всех промежуточных индексов васкуляризации. В табл. 1

На третьем этапе на срезах с парафиновых блоков СЖ, предназначенных для стандартного морфологического исследования, проводили иммуногистохимический (ИГХ) анализ. В работе использовали первичные антитела (АТ) и их разведения (табл. 2).

Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. Для «демаскировки» антигенов срезы прогревали на водяной бане в предварительно нагретом до 95—99 °С цитратном буфере в течение 45 мин. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15—20 мин и переносили в фосфатный буфер на 5 мин. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 20 мин в темноте с 3% раствором перекиси водорода, приготовленным на дистиллированной воде, а затем промывали 5 мин в фосфатном буфере. Для блокирования неспецифического связывания АТ срезы инкубировали 15 мин с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными АТ проводили при 4 °С в течение 40 мин. После первичных АТ стекла промывали дважды по 5 мин в фосфатном буфере.

Инкубацию со вторыми АТ (LSAB+kit, «DAKO») проводили при комнатной температуре в течение 20 мин, затем срезы промывали дважды по 5 мин. Инкубацию с АТ, меченными стрептавидином (LSAB+kit, «DAKO»), проводили при комнатной температуре в течение 20 мин, затем срезы промывали трижды по 5 мин. Для визуализации ИГХ-реакции использовали систему DAB+ («DAKO»). Реакцию проводили в темноте в течение 5—10 мин. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам.

Негативным контролем служила ИГХ-реакция без добавления первичных АТ.

Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа Carl Zeiss Аxiolab E-re (Германия) при увеличении ×10, ×20, ×40. Для всех маркеров оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана).

В исследовании применяли следующие критерии оценки ИГХ-реакции:

— отрицательной (–) считали реакцию при отсутствии специфического окрашивания ацинусных клеток СЖ или при наличии до 10% окрашенных клеток от всей площади ткани СЖ;

— слабоположительной (+) реакцию расценивали при окрашивании от 10 до 30% ацинусных клеток;

— умеренноположительной (++) считали реакцию при экспрессии маркера от 30 до 75% клеток;

— экспрессию маркера более 75% клеток расценивали как выраженную реакцию (+++).

При оценке результатов иммунофенотипирования (с тканедифферентационными маркерами) подсчитывали среднее количество положительно окрашенных клеток в пяти полях зрения. Высчитывали средний результат (табл. 3).

Данные, полученные на биоптатах СЖ пациентов с ЭОП, были сопоставлены с аутопсийными биоптатами.

Аутопсийные биоптаты неизмененных СЖ отличались четко дифференцированными дольками (A, B, C,), разделенными междольковой соединительной тканью (D), содержащей умеренное количество кровеносных сосудов (1) и междольковыми слезными протоками (2). Дольки СЖ состояли из ацинусов (3) и внутридольковых протоков, разделенных нежными прослойками внутридольковой соединительной ткани. Внутридольковая строма была пронизана единичными мелкими кровеносными сосудами (4) и нервами (рис. 1).

В цитоплазме немногочисленных плазмоцитов (2) и на внутренней поверхности мелких сосудов (1) имела место выраженная ИГХ-реакция (+++) на IgG. Обнаружены депозиты положительно окрашенного вещества в межацинарной строме (3) (рис. 2).

Патоморфологические изменения СЖ при ЭОП заключались в расширении просвета ацинусов (1), составляющих дольку, а также просвета внутридольковых протоков (2). Эпителий ацинусов уплощался за счет застоявшегося секрета (3), визуализирующегося в их просветах в виде аморфных эозинофильных масс. Отмечалось уплотнение и расширение площади внутридольковой стромы по сравнению с нормой. При этом междольковые соединительнотканные перегородки значительно утолщались, уплотнялись и были пронизаны большим количеством кровеносных сосудов различного диаметра. В междольковых перегородках отмечалось большое количество очаговых скоплений лимфоцитов (4). Имела место интенсивная диффузная лимфоидная инфильтрация (5) собственно ткани СЖ (рис. 3).

В измененных СЖ (рис. 4)

Описанные ИГХ-изменения в экспрессии иммуноглобулинов сопровождались морфологическими изменениями. В микропрепаратах СЖ при ЭОП отмечали значительное утолщение междольковых и внутридольковых соединительнотканных прослоек преимущественно за счет накопления грубоволокнистого, плотного коллагена, сдавливающего и деформирующего ацинусы и протоки СЖ. Это приводило к накоплению секрета в просвете вышеупомянутых структур, который, в свою очередь, сдавливал эпителиальные клетки, приводя к их атрофии, а также к эктазии слезных протоков. В цитоплазме большинства секреторных клеток отмечали образование светлых вакуолей, что было проявлением дистрофии эпителиальных клеток. В отдельных просветах протоков и ацинусов наблюдали скопления слущившегося эпителия. Обращали на себя внимание участки пролиферации секреторного эпителия с гнездными скоплениями хаотично расположенных клеток и гиперплазией эпителия ацинусов и протоков. В междольковой фиброзно-измененной строме СЖ отмечалось большое количество очаговых лимфоидных инфильтратов, образующих структуры, напоминающие лимфоидные фолликулы. При иммунофенотипировании было обнаружено, что около 70% клеток лимфоидного ряда в упомянутых скоплениях являются В-лимфоцитами (CD20), около 25% клеток — CD4-Т-лимфоцитами (Т-хелперы) и около 5% клеток — CD8-Т-лимфоцитами (Т-киллеры). Наряду с очаговой наблюдалась диффузная лимфоидная инфильтрация стромы СЖ.

Междольковая соединительная ткань СЖ при ЭОП отличалась большим количеством сосудов различного диаметра, преимущественно малого. Индекс васкуляризации при ЭОП в 3 раза превышал показатели нормы:

достигая М_ср. (М±m) =0,06±0,01. В норме средние значения индекса васкуляризации составляли М_ср. (М±m) =0,02±0,009, а индекса фиброза — М_ср. (М±m) =0,33±0,11 (см. табл. 1; рис. 5, а—г).

В целом описанная морфологическая картина СЖ при ЭОП соответствовала длительно протекающему хроническому неспецифическому воспалению вне фазы обострения. Учитывая нехарактерную для хронических инфекционных процессов картину, отсутствие признаков эндогенных и экзогенных веществ и глистной инвазии, способных вызвать хроническое воспаление, а также наличие эозинофильной инфильтрации стенок сосудов и обилие депозитов IgG, можно утверждать, что это хроническое воспаление носит аутоиммунный характер.

При детальном сопоставлении морфологической картины CЖ в норме и при ЭОП выявлен ряд важных отличий. Одним из основных являлось наличие лимфоидных фолликулов и участков очаговых лимфоидных скоплений, а также более выраженная диффузная лимфоидная инфильтрация собственно ткани СЖ при ЭОП. Наряду с этим отмечалась разница количественного и качественного состава лимфоцитарного инфильтрата (см. табл. 3).

Как видно из табл. 3, подавляющее большинство лимфоидных клеточных элементов в инфильтрате представлены В-лимфоцитами, что подтверждает аутоиммунный характер воспаления СЖ при ЭОП.

При количественной оценке выраженности фиброза и васкуляризации СЖ в норме и при ЭОП также выявлены существенные различия. Они заключались в достоверном превышении количества сосудов на единицу площади в зоне просмотра ткани СЖ при ЭОП. Вовлечение СЖ в аутоиммунный процесс при ЭОП завершалось формированием обширных зон фиброза в междольковых и внутридольковых соединительнотканных прослойках с уменьшением пропорции функциональных структур (ацинусов), участвующих в секреции. Формирование фиброза сопровождалось сдавлением и деформацией сохранившихся ацинусов и протоков СЖ, в просвете которых накапливался секрет, дополнительно компрессирующий эпителиальные клетки, приводя к их атрофии и к эктазии слезных протоков.

Представляет научно-практический интерес тот факт, что при ЭОП в СЖ отмечается более высокая пролиферативная активность секреторных клеток СЖ: 17% Ki-67-позитивных клеток против единичных делящихся клеток в норме (выявлено ИГХ-реакцией с АТ к ядерному белку пролиферации Ki-67). Вероятно, повышенная пролиферативная активность секреторных клеток СЖ при ЭОП может быть объяснена попыткой репарации структурно-анатомических и функциональных свойств органа при завершении аутоиммунного воспаления.