ГЭБ — гематоэнцефалический барьер

ИКБ — иксодовые клещевые боррелиозы

КЭ — клещевой энцефалит

МИ — смешанная (микст) инфекция

НБ — нейроборрелиоз

ПЯЛ — полиморфно-ядерные лейкоциты

СМЖ — спинномозговая жидкость

ЦНС — центральная нервная система

NOS — NO-синтаза

Клещевой энцефалит (КЭ), иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) и их сочетанные формы представляют актуальную проблему для здравоохранения большинства эндемичных территорий Российской Федерации. КЭ на современном этапе характеризуется явлением патоморфоза. На Южном Урале доминирует сибирский генотип вируса КЭ, азиатский кластер, субгенотип Заусаев [1, 2]. Этиология летальных случаев КЭ (менингоэнцефалитические формы) в Челябинской области обусловлена субгенотипами Заусаев и Васильченко [3]. Предполагается, что гетерогенность антигенных свойств субтипов вируса КЭ может определять преобладание того или иного пути попадания в центральную нервную систему (ЦНС). Патоморфологическая картина при КЭ значительно отличается при заражении «западными» и «восточными» штаммами вируса. «Западные» штаммы обладают глиетропностью, вызывая мезенхимально-инфильтративные изменения в ЦНС, а «восточные» штаммы — нейротропностью, вызывая первично-дегенеративные изменения нервных клеток. Особенности патогенеза различных штаммов вируса, несомненно, обусловливают различные клиническую картину, течение и исход болезни на разных эндемичных территориях нозоарела ВКЭ. Частота неврологических расстройств у больных ИКБ в различных регионах России варьирует от 20% на Среднем Урале до 35—43% в Северо-Западной и Центральной частях [4, 5]. При этом наблюдается поражение как периферических, так и центральных отделов нервной системы [6]. Данные, полученные в последние годы, отражают высокую частоту инфицирования боррелиями больных с хроническими прогрессирующими неврологическими заболеваниями и больных с так называемыми последствиями нейроинфекций. Среди них энцефаломиелиты, псевдотумор, рассеянный склероз, амиотрофии, энцефалопатии, депрессивные эпизоды, психические нарушения. Терапия таких форм сложна, использование препаратов этиотропного действия не всегда приводит к клинически значимому результату. Даже при кажущейся полной санации организма возбудитель успевает вызвать аутоиммунные, дегенеративные и воспалительные процессы, способствующие развитию вторичных тяжелых поражений нервной ткани [7, 8]. Основными направлениями патогенетической терапии нейроинфекций являются: нормализация перфузии мозга и уменьшение интоксикации, дегидратационная терапия, уменьшение явлений гипоксии мозга (назначение антигипоксантов, гипербарическая оксигенация), улучшение трофики и микроциркуляции головного мозга (использование сосудистых препаратов, нейропептидов), уменьшение неврологического дефицита (ноотропы, мультивитамины), противосудорожные препараты, лечение осложнений (отека-набухания головного мозга в условиях отделения реанимации и интерсивной терапии).

Современные терапевтические стратегии, базирующиеся на принципах энергокоррекции, рассматриваются как эффективные методы нейропротекции [9]. Оксид азота (NO) вместе с другими радикалами индуцирует апоптоз, усиливает окислительный стресс мембран нейронов и клеток нейроглии [10]. Специфическая патогенетическая фармакотерапия может быть направлена на одно из звеньев в патогенезе клещевых нейроинфекций, а именно на усиление нитроксиднегативного эффекта, в том числе при применении метаболических средств. При этом необходимо учитывать то важное обстоятельство, что NO вовлекается как в нормальную регуляцию, так и во многие патофизиологические процессы [11]. Оптимальный лекарственный препарат должен обладать способностью ограничивать гиперпродукцию NO и при этом не затрагивать существенные регуляторные и защитные функции NO.

Цель исследования: изучить семиотику неврологических поражений у больных КЭ, ИКБ и смешанной (микст) инфекцией (МИ), их иммунопатогенез, возможности современной патогенетической фармакокоррекции

Под наблюдением находились 537 больных с различными клиническими формами КЭ, ИКБ и МИ — 310 (57,7%) мужчин и 227 (42,3%) женщин в возрасте от 17 до 70 лет. Методом сплошной выборки сформирована популяция, в которую вошли 220 больных с синдромами поражения ЦНС. Обследование и лечение больных осуществляли на базе клиники кафедры инфекционных болезней ФГБОУ ВО ЮУГМУ, городского центра нейроинфекций, 1-го и 4-го инфекционных отделений ГКБ № 8 Челябинска. Наряду с обычными клиническими и лабораторными методами оценки крови, спинномозговой жидкости (СМЖ) с целью верификации диагноза использовали дискриминаторные для каждой патологии тесты: иммуноферментный анализ с тест-системами Боррелиоз-ИФА-IgM, Боррелиоз-ИФА-IgG производства НПФ «Омникс» (Санкт-Петербург), коммерческие наборы тест-систем производства «Вектор-Бест» для определение специфических антител класса IgM и IgG к ВКЭ; полимеразную цепную реакцию с тест-системой Векто-Лайм-ДНК-ампли-100, производства «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Клеточный состав мононуклеаров, популяционный и субпопуляционный спектр лимфоцитов СМЖ изучали методом лазерной проточной цитометрии на цитофлюориметре фирмы «Beckman Coulter», модель Epics XL с использованием моноклональных антител с тройной меткой фирмы «CALTAG Laboratories» против CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD20⁺, CD14⁺, CD33⁺, CD95⁺, CD16 (56) ⁺.

Количественную оценку содержания NO в СМЖ и крови проводили фотоколориметрическим методом с помощью реакции Грисса в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002) по суммарному содержанию конечных стабильных метаболитов NO.

С целью фармакотерапевтической коррекции использован метаболический препарат цитофлавин (торговое название) по новым показаниям. Методом адаптивной рандомизации сформированы 2 группы: 1-я — 35 пациентов, получавших базисную терапию; 2-я — 35 пациентов, получавших базисную терапию + цитофлавин. Способ лечения заключался в однократном внутривенном капельном медленном введении 10 мл цитофлавина в 200 мл 5% раствора глюкозы в течение 7 дней. Средства базисной терапии: иммуноглобулин против КЭ в титре 1:80, 1:160 в стандартных курсовых дозах внутримышечно, рибамидил внутрь при КЭ, цефалоспорины 3-го поколения при нейроборрелиозе (НБ) и МИ по 2 г внутривенно, стандартная инфузионная терапия, диуретики, восстановительная терапия (церебролизин, ноотропил).

Обработку данных с последующим статистическим анализом осуществляли стандартными методами вариационной статистики в рамках программы Statistica for Windows, версия 6,0. Для проверки «нулевой» гипотезы использовали непараметрические критерии: критерий U Манна—Уитни, двухвыборочный критерий Колмогорова—Смирнова, парный критерий Вилкоксона. В исследовании использована статистическая гипотеза о равенстве математического ожидания значений остаточного ряда, метод наименьших квадратов для оценки уравнения регрессии.

Инкубационный период варьировал от 3 до 30 сут, у больных с КЭ и МИ в среднем составлял 12,2±2,4 дня, у больных ИКБ—9,4±2,2 дня. Семиотика неврологических расстройств у больных КЭ, ИКБ, МИ включала менингеальный синдром (143 наблюдения), менингоэнцефалитический (27), менингоэнцефалополиомиелитический (17), менингополирадикулоневритический (9) и крайне редко полиомиелитический (5). Полирадикулоневритический синдром чаще наблюдался у больных МИ и собственно ИКБ, являясь казуистикой для больных КЭ (0,6%). Общемозговая симптоматика у больных КЭ представлена головной болью различной интенсивности в 100% случаев, тошнота и рвота несколько чаще встречались при тяжелом течении КЭ. В изучаемой группе у 96,8% больных объективно определялся менингеальный симптомокомплекс. У 14,7% больных с менингеальными формами КЭ наблюдалась преходящая микроочаговая неврологическая симптоматика в виде непостоянных пирамидных знаков, анизорефлексии, легкой дискоординации движений. Среди очаговых форм наиболее часто встречались менингоэнцефалитическая у 20 (11,7%) больных, менингоэнцефалополиомиелитическая у 15 (8,8%). В ряде случаев очаговые формы дебютировали с эпилептиформных припадков. Дыхательные расстройства на фоне нарушенного сознания, бульбарный синдром, прогрессирующий полиомиелитический синдром со слабостью дыхательных мышц и их различные сочетания служили показанием к искусственной вентиляции легких в 80% случаев. Семиотика клинических проявлений очаговых форм КЭ определялась уровнем поражения ЦНС. Однако у большинства больных наблюдались симптомы диффузного поражения ЦНС.

Семиотика неврологических поражений у больных ИКБ включала серозные менингиты (у 6), менингоэнцефалиты (у 2), менингополирадикулоневриты (у 2), мононевриты (у 3). Неврологические расстройства чаще регистрировались у больных с безэритемными формами ИКБ. Из краниальных невритов мы наблюдали поражение лицевого нерва, которое в 3 случаях локализовалось ниже отхождения барабанной струны и не сопровождалось нарушением слезоотделения и вкуса. Алгический синдром (преимущественно миалгии) наблюдался у 60 больных ИКБ, у одной больной зарегистрирован миофасциальный триггерный синдром. Общемозговые и менингеальные симптомы, как правило, появлялись не ранее 10—12-го дня болезни. В 43% случаев менингеальный симптомокомплекс возникал на второй волне лихорадки.

Сравнительный анализ клинической картины у больных МИ и КЭ показал, что для МИ (ИКБ+КЭ) характерно превалирование в клинической картине синдромов, характерных для К.Э. При этом клиническая симптоматика в 45,4% случаев проявлялась как лихорадочная форма, в 23,2% как менингеальная, в 12,8 и 18,6% как очаговая и стертая формы КЭ соответственно.

На основе обычного цитологического и биохимического исследования СМЖ выявлены повышение общего количества клеток в СМЖ и лимфоцитарный плеоцитоз, являющийся дифференциально-диагностическим признаком клещевых нейроинфекций. Общее количество клеток в СМЖ пациентов было максимальным при НБ (Ме 360 клеток/мл) и минимальным при менингеальных формах КЭ (Ме 107). При тяжелом течении инфекционного процесса, несмотря на преобладание лимфоцитов, отмечался рост относительного количества нейтрофилов в СМЖ, наибольшее процентное соотношение которых получено у больных МИ — сочетание очаговых форм КЭ с безэритемными формами ИКБ — Ме 19 (8; 32) %.

При исследовании СМЖ 10 больных КЭ и 5 с МИ с помощью проточной цитофлюориметрии установлено преобладание в СМЖ мононуклеарных клеток, при этом лимфоциты СD3⁺ составили 58,6%, а СD14⁺ — 34,4%. Количество лимфоцитов CD4⁺ достигало 57,2%, CD8⁺ — всего 16,8%. Число лимфоцитов СD20⁺ было минимальным (2,62%), а клеток CD16/56⁺ составило 7,68%. В исследуемой группе больных процент лимфоцитов СМЖ, экспрессирующих рецепторготовности к апоптозу, зависимому от Fas (CD95), был очень высоким — 64,3. Результаты изучения популяционного и субпопуляционного состава мононуклеаров СМЖ больного НБ (поражение ЦНС по типу менингоэнцефалита, из СМЖ выделен геновид B. garinii) представлены на рис. 1, где показаны популяции (гейты) лимфоцитов СМЖ, экспрессирующие фенотипические маркеры CD4⁺, CD8⁺, CD14⁺. Содержание клеток СD3⁺СD4⁺ в СМЖ пациента с НБ было очень высоким — 77,2% (для сравнения при КЭ 58,6%, при МИ 60,4%), число клеток CD8⁺— 13,7% (при КЭ 16,8%, при МИ 35,7%), процент B-лимфоцитов достигал 1,74%, CD16/56⁺ — 3,21% (при КЭ 7,68), клеток CD14⁺ — 43,8% (при КЭ 34,4%). В остром периоде выявлено достоверное повышение содержания конечных стабильных метаболитов оксида азота (NO₂, NO₃, NO_x) в сыворотке крови у больных КЭ, ИКБ, МИ (табл. 1). При этом оценка концентрации нитратов оказалась более информативной, чем нитритов (p<0,001). Степень нитроксидемии соотносилась с тяжестью течения заболеваний. Тяжелое течение МИ сопровождалось максимальным содержанием в сыворотке крови продуктов нитроксид-молекулы (39,7 мкмоль/л). Концентрация нитратов в крови больных КЭ, ИКБ и МИ превышала содержание нитритов в 3,2—5,6 раза. Анализ СМЖ больных клещевыми нейроинфекциями показал, что в данном биологическом материале соотношение между концентрацией нитритов и нитратов сходно с тем, которое наблюдалось в крови, т. е. большую часть составляют нитраты (табл. 2). Исследование СМЖ оказалось более информативным в сравнении с анализом нитроксидергических показателей крови, так как уровни нитратов и суммарных конечных стабильных метаболитов нитроксид-молекулы в СМЖ у больных ИКБ, КЭ и МИ в 5,3—5,8 раза достоверно выше, чем у здоровых лиц. Аналогичные показатели в сыворотке крови превышали показатели контрольной группы в 2—2,3 раза.

Методом наименьших квадратов между суммарной концентрацией метаболитов нитроксид-молекулы и процентным содержанием клеток, экспрессирующих маркер CD14, установлена корреляция (r_ух=0,505; p<0,01), что делает предположение о моноцитарно-макрофагальном происхождении NO в СМЖ правомерным. Графически модель представлена на рис. 2. При этом 25,5% вариации переменной Y учтено в модели и обусловлено влиянием фактора Х. Коэффициент эластичности (Э 0,335) показывает, что при изменении Х на 1%, величина Y возрастает на 0,335%. На основании гипотезы о равенстве математического ожидания (Е=0), критерия поворотных точек, критерия d Дарбина—Уотсона (d=1,639), критерия RS (RS=2,731) модель считается адекватной.

Анализ содержания NO₂, NO₃, NO_x в двух сформированных клинических группах выявил достоверные изменения для нитритов — 2,70 (1,90; 2,95; p=0,001) и суммарных метаболитов NO —18,00 (18,00; 22,60; p=0,006) и статистически вероятные изменения для нитратов — 13,29 (15,70; 20,30; p=0,075 в парном тесте Вилкоксона) у больных, получавших инфузиии цитофлавина (табл. 3). Достоверно уменьшалась длительность менингеального синдрома у больных 2-й группы (5,1±2,1 дня; p<0,05) и продолжительность стационарного лечения у больных с серозными менингитами (18,3±1,7 дня; p<0,05). Таким образом, использование цитофлавина с целью нейромедиаторной поддержки в терапии КЭ, МИ и ИКБ с преимущественным поражением нервной системы оказало нитроксиднегативный эффект, что привело к более быстрому регрессу менингеального синдрома и позволило сократить продолжительность стационарного лечения при менингитах.

Выявленные нейродинамические и ликворологические нарушения у больных КЭ, ИКБ и МИ лежат в основе многих клинических синдромов острого периода заболевания и при своевременной и соответствующей терапевтической коррекции могут подвергаться обратному развитию, что подтвердилось в большинстве случаев при динамическом наблюдении за больными. Уровень цитоза коррелировал со степенью тяжести заболевания и составил при среднетяжелом течении (64,6±10,3)·10⁶/л, при тяжелом (362,1±36,7)·10⁶/л. Кроме того, при тяжелом течении инфекционного процесса отмечался рост относительного количества нейтрофилов в СМЖ. У больных с тяжелым и среднетяжелым течением менингеальной формы КЭ отмечался умеренный лимфоцитарный плеоцитоз, при этом число лимфоцитов в СМЖ при средней степени тяжести заболевания в 3 раза превышало число нейтрофилов, а при тяжелой степени тяжести — только в 1,83 раза. Полученные данные отражают роль полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в формировании более тяжелого течения клещевого энцефалита. У всех больных была положительная глобулиновая реакция Панди и наблюдалось некоторое повышение уровня общего белка в СМЖ (при среднетяжелых формах 621±25,4 мг/л, тяжелых 754,3±19,3 мг/л). Таким образом, увеличение содержания белка в СМЖ может быть связано с активацией ПЯЛ и повышенной локальной секрецией многофункциональных белков этими клетками. Кроме того, ПЯЛ относятся к типичным клеточным флогогенным медиаторам и могут активно участвовать в развитии воспаления, увеличивать проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), что обеспечивает поступление белков из сосудистого русла.

Цитофлюориметрическое изучение клеточного состава СМЖ показало, что cреди мононуклеарных клеток СМЖ преобладали CD3⁺-, CD4⁺-, CD8⁺-лимфоциты и моноциты, экспрессирующие CD14±маркер. Таким образом, в ответ на проникновение патогенов в ЦНС формируется определенное соотношение иммунных клеток в СМЖ, отражающее характер локальной иммунной реакции при КЭ и НБ: увеличение иммунорегуляторного индекса СD4⁺/CD8⁺ от 3,4 до 5,6 соответственно, в то время как нормальная пропорция этих клеток в крови варьирует в диапазоне от 1,5 до 2,2. Полученные данные о росте пропорции СD4⁺/CD8⁺-клеток СМЖ, а также существенные различия этого показателя с индексом периферической крови отражают превалирование хелперной субпопуляции в СМЖ больных ИКБ, КЭ и, возможно, свидетельствуют об активной экстравазации лимфоцитов в связи с нарушением ГЭБ, а также локальной клональной экспансии лимфоцитов, связанной с формированием специфического иммунного ответа в пределах ЦНС. Лимфоциты CD3⁺ играют важную роль в инициации зависимой от CD4-формы воспаления, привлечении макрофагов в очаг локальной инфекции, а также необходимы для пролиферации и дифференцировки B-клеток. Действительно, в СМЖ одновременно с увеличением числа лимфоцитов СD3⁺ в острой фазе НБ и КЭ повышается количество клеток CD14⁺, что можно оценить как адекватный ответ клеток макрофагального ряда на увеличение числа Т-хелперов в СМЖ и позволяет предполагать зависимую от Т-лимфоцитов активацию функции макрофагов. Зарегистрированное уменьшение количества лимфоцитов CD8⁺, основная роль которых в иммунном ответе заключается в устранении клеток, контаминированных патогенами в результате цитотоксического действия на зараженные клетки, свидетельствует о некотором дефиците цитотоксических лимфоцитов на 2—3-й день острой фазы НБ и КЭ в сравнении с числом хелперной субпопуляции клеток, и более ранним ответом лимфоцитов CD4⁺. При М.И. не наблюдалось такого снижения содержания лимфоцитов СD8⁺, при этом хелперно-супрессорный коэффициент составил 1,8.

В полном соответствии с результатами анализа популяционного спектра мононуклеаров СМЖ в острой фазе клещевых нейроинфекций находятся данные о состоянии нитроксидергических процессов. Вместе с увеличением числа клеток CD14⁺ в СМЖ у больных выявлено существенное повышение содержания конечных метаболитов NO. Известно, что продукция NO в ЦНС осуществляется с помощью нейрональной NO-синтазы (NOS 1-го типа), впервые полученной из нейронов ЦНС, а также индуцибельной ее формы (NOS 2-го типа), источником которой являются эндотелиоциты, в основном моноциты и макрофаги, о росте уровня которых свидетельствует увеличение клеток CD14⁺ в СМЖ у обследованных пациентов. Рост продукции метаболитов NO зафиксирован также на уровне крови, что позволяет предполагать вазодилатационный эффект NO и связанный с ним рост проницаемости ГЭБ с распространением NO как газового мессенджера по объему с преодолением барьера по градиенту концентрации. По современным представлениям, кровеносные сосуды всегда находятся в состоянии активного дилататорного тонуса, выраженность которого определяется главным образом конститутивной NOS, локализующейся в сосудистом эндотелии. Эндотелий ГЭБ разграничивает различающиеся как морфологически, так и функционально кровь и нервную ткань мозга.

Результаты исследований показали, что нейроформы клещевых инфекций сопровождаются отчетливо выраженной гипернитроксидемией, определяемой по достоверному увеличению концентраций конечных стабильных метаболитов нитроксид-молекулы в крови. Подобная направленность изменений изученных нитроксидергических показателей свидетельствует о повышении в организме больных с указанной патологией продукции эндогенного NO. Целесообразность модификации базисной терапии по варианту усиления ее нитроксиднегативного потенциала подтверждена положительными сдвигами лабораторных показателей у больных 2-й группы. Это позволяет сделать вывод о ингибирующем влиянии цитофлавина на продукцию эндогенного NO. Показатели статистически достоверны в парном тесте Вилкоксона. Воздействие цитофлавина на метаболизм нитроксид-молекулы можно объяснить его составом, в который входят известные фармакологические препараты. Помимо улучшения мозгового метаболизма, восстановления антиоксидантной активности клеток, активируются ГАМКергические (трофотропные) системы ЦНС в противодействие эрготропным, что обусловливает его нейропротекторное действие. Способ патогенетической коррекции нитроксидергических процессов при клещевых нейроинфекциях защищен патентом на изобретение [12].

У больных клещевыми нейроинфекциями между фагоцитирующими, антигенпрезентирующими и иммунокомпетентными лимфоцитами формируется локальный Th-1 — зависимый иммунный ответ. К впервые выявленным особенностям клеточного состава СМЖ следует отнести высокий процент лимфоцитов СМЖ с фенотипическим маркером СD95+, отражающим готовность к FAS — зависимому апоптозу. Гиперпродукция флогогенного медиатора (NO), определяемая по достоверному приросту концентрации конечных метаболитов NO в сыворотке крови и СМЖ, требует фармакологической коррекции. Использование цитофлавина в качестве средства нейромедиаторной поддержки для коррекции нитроксидергических процессов патогенетически обоснованно.