АИЗ — аутоиммунное заболевание

БГ — болезнь Грейвса

ОШ — отношение шансов

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ТТГ — тиреотропный гормон

ЩЖ — щитовидная железа

ЭОП — эндокринная офтальмопатия

Эндокринная офтальмопатия (ЭОП) — потенциально опасное для зрения, хроническое аутоиммунное заболевание (АИЗ) глаз, ассоциированное с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (ЩЖ) и характеризующееся отеком и лимфоцитарной инфильтрацией ретробульбарной клетчатки и экстраокулярных мышц. Особенностью данного заболевания является определяющая роль роста мягких тканей, а не их деструкции, что в 5% случаев приводит к развитию крайне тяжелой ЭОП с компрессией зрительного нерва, изъязвлением роговицы и потерей зрения. Однако даже легкая форма ЭОП может значительно снизить качество жизни пациента. При этом течение заболевания трудно прогнозировать и внезапное ухудшение может наступить в любое время.

Предполагается, что ЭОП, как и другие АИЗ, является многофакторным заболеванием, при котором сочетание генетической предрасположенности с неблагоприятным действием факторов окружающей среды запускает каскад реакций в иммунной системе, приводящий к аутоагрессии с поражением ретробульбарной клетчатки и экстраокулярных мышц. В качестве первичного аутоантигена предложен рецептор тиреотропного гормона (ТТГ), экспрессируемый в ретробульбарной клетчатке. Аутоиммунная активация фибробластов орбиты приводит к усиленному адипогенезу, избыточному синтезу глюкозаминогликанов и экспрессии иммуномодуляторов в орбите и как следствие отеку и увеличению в объеме мягких тканей орбиты с последующим развитием экзофтальма, нарушения подвижности глаз, компрессии зрительного нерва и изъязвления роговицы [1]. Показано, что табакокурение, пожилой возраст, мужской пол и терапия радиоактивным йодом ассоциированы с развитием и тяжестью ЭОП. Существует также некие этнические различия по распространенности ЭОП среди пациентов с БГ, с меньшим риском среди представителей монголоидной расы по сравнению с лицами европеоидной равсы, проживающими в том же регионе [2].

Приблизительно в 90% случаев ЭОП ассоциирована с болезнью Грейвса (БГ) — одного из самых распространенных АИЗ ЩЖ, характеризующейся стойким повышением продукции тиреоидных гормонов. Известно, что БГ и ЭОП чрезвычайно сходны по патогенезу, ключевую роль в котором играют антитела к рецептору ТТГ. Однако только у 25—50% пациентов с БГ развивается клиническая картина ЭОП, и это может быть связано с тем, что это два различных заболевания с разной генетической предрасположенностью [2]. Роль генетических факторов в развитии ЭОП остается неясной. Актуальность изучения молекулярной генетики ЭОП обусловлена, главным образом, возможностью приблизиться к идентификации генов, предрасполагающих к ЭОП, и понять, какие именно гены и как определяют развитие и течение этого заболевания, оценить вклад генов в генетическую предрасположенность к ЭОП, оценить влияние генетической предрасположенности на прогноз течения, эффективность лечения и исходы заболевания. В настоящее время изучение генетической предрасположенности к ЭОП осуществлялось преимущественно на ряде монголоидных популяций. Необходимость проведения исследования у больных русского происхождения не вызывает сомнений, так как известно, что вклад различных генов в формирование предрасположенности к АИЗ существенно различается в разных популяциях и тем более в разных этнических группах.

Целью настоящего исследования являлся анализ ассоциаций полиморфного маркера rs3087243 гена CTLA4 и rs1800629 гена TNF с ЭОП у пациентов русского происхождения с БГ.

В исследовании случай—контроль обследовали 205 пациентов русского происхождения с БГ, 148 женщин и 57 мужчин. Выборка была этнически однородна. Диагноз Б.Г. устанавливали на основании данных анамнеза, тиреоидного статуса, результатов ультразвукового исследования ЩЖ, положительных антител к рецептору ТТГ. Пациентов разделили на 2 группы: имеющие клиническую картину ЭОП любой активности и степени тяжести по результатам офтальмологического обследования и инструментальных исследований орбит и не имеющие клинической картины ЭОП. Группу с ЭОП (БГ+ЭОП) составил 141 пациент, в том числе 40 мужчин и 101 женщина, средний возраст манифестации БГ 43,8 (17; 80) года. Группу без ЭОП (БГ-ЭОП) составили 64 больных, в том числе 17 мужчин и 47 женщин, средний возраст 42,2 (20; 70) года.

Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых осуществляли методом фенолхлороформной экстракции после инкубации образцов крови с протеиназой К в 0,1% растворе додецилсульфата натрия. Термостабильная ДНК-полимераза получена от фирмы «Диалат» (Москва, Россия), протеиназа К от фирмы «Диа-М» (Москва, Россия). Фрагменты геномной ДНК, содержащие полиморфные участки генов-кандидатов, амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере BI 7500 Fast («Applied Biosystems»).

Амплификацию полиморфного участка rs3087243 гена CTLA4 проводили с помощью ПЦР на термоциклере Bio-Rad Dyad Thermal Cycler («Bio-Rad», США) в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ трис-HCl, pH 8,8; 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01% твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров 1,5 ед. ДНК-полимеразы, 50—100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: денатурация 1 мин при температуре 94 °C, отжиг 1 мин при 56 °C, элонгация 1 мин при температуре 72 °C — 35 циклов. Размер продукта амплификации 122 п.н. Образовавшийся фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазой BstHHI (Сибэнзим) в буфере Y (33 мM трис-ацетат (pH 7,9 при температуре 25 °C); 10 мM ацетата магния; 66 мM ацетата калия; 1 мM дитиотриэтола + BSA) при температуре 50 °C в течение 12—16 ч. После обработки рестриктазой фрагмента ДНК, содержащего аллель G, образуются продукты размером 95 и 27 п.н., в то время как в случае фрагмента, содержащего аллель A, ДНК остается нерасщепленной. Разделение продуктов расщепления проводили в 2% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием. Наличие фрагмента длиной 122 п.н. после расщепления рестриктазой BstHHI соответствует генотипу AA, двух фрагментов 95 и 27 п.н. — генотипу GG и трех (122, 95 и 27 п.н.) — гетерозиготному генотипу GA. Последовательности праймеров представлены в табл. 1.

Идентификацию аллелей полиморфного участка rs1800629 гена TNF проводили с помощью гибридизационно-флюоресцентного анализа (TaqMan-анализ) на амплификаторе в реальном времени ABI 7500 fast («Applied Biosystems», США) в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ трис-HCl pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01% твин-20, 2 мМ хлорид магния, 0,2 мМ каждого dNTP, по 33 нг праймеров и зондов, 1,5 ед.акт. полимеразы Taq, 50—100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95 °C/2 мин — первый цикл; 94 °C/10 с, 60 C/60 с — 40 циклов. Последовательности праймеров и зондов представлены в табл. 1. Анализ продуктов амплификации проводили методом анализа кривых плавления с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета программ SPSS 19.0. Распределение аллелей и генотипов изученных локусов в группах больных сравнивали с использованием критерия χ². Достоверными считали различия при р<0,05. Отношение шансов (OШ) рассчитывали по соответствующей формуле. OШ=1 рассматривали как отсутствие ассоциации, OШ >1 свидетельствовало о наличии предрасположенности (фактор риска), OШ <1 — о предохраняющем действии (защитный фактор) генетического маркера (аллеля или генотипа) к развитию патологии.

Клиническая характеристика пациентов в двух группах представлена в табл. 2. Не выявлено существенных различий между пациентами с ЭОП и без ЭОП, как по полу (соответственно 28,4 и 26,6% мужчин и 71,6 и 73,4% женщин; р=0,789), так и по возрасту манифестации БГ (соответственно 43,8 и 42,2 года; р=0,589). Однако имелись существенные различия по тактике лечения тиреотоксикоза, в группе пациентов с БГ и ЭОП доля радикальных методов лечения была больше, чем у пациентов с БГ без ЭОП (41,8 и 10,9% соответственно; p<0,001). Это связано с более тяжелым течением тиреотоксикоза, отсутствием компенсации на фоне консервативного лечения и высоким риском рецидивов заболевания у пациентов с ЭОП. Оценивали вклад негенетических факторов риска развития ЭОП у пациентов с БГ, в том числе курения. В нашем исследовании показано, что доля курильщиков больше среди пациентов с ЭОП (41,8 против 26,5; p=0,036). Курение обусловливает увеличение частоты манифестации ЭОП у пациентов с БГ почти в 2 раза (OШ 1,989 при 95% доверительном интервале — ДИ от 0,995 до 4,009).

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs3087243 гена CTLA4 и rs1800629 гена TNF в группах индивидов с БГ+ЭОП и БГ-ЭОП показал, что распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди—Вайнберга (табл. 3).

Частота аллеля, А полиморфного маркера rs3087243 гена CTLA4 оказалась выше в группе пациентов с ЭОП, частота аллеля G — в группе пациентов с БГ без ЭОП (p=0,003). Генотип А.А. достоверно чаще встречался в группе БГ+ЭОП, генотип GG — в группе БГ-ЭОП (p=0,01). Таким образом, наши данные показали, что аллель, А (OШ 2,00 при 95% ДИ от 1,27 до 3,15) и генотип АА (OШ 3,55 при 95% ДИ от 1,19 до 10,63) ассоциированы с повышенным риском развития ЭОП в русской популяции. При этом аллель G (OШ 0,5; 95% ДИ от 0,32 до 0,78) и генотип GG (OШ 0,47; 95% ДИ от 0,26 до 0,86), напротив, ассоциированы с пониженным риском развития ЭОП.

Достоверных различий по распределению частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1800629 гена TNF среди пациентов с БГ+ЭОП и БГ-ЭОП не обнаружено.

Данные мировой литературы по изучению роли генетических маркеров в манифестации ЭОП у пациентов с БГ немногочисленны и противоречивы. Это обусловлено как разной этнической принадлежностью, так и различиями в критериях включения в исследуемые группы. Кроме того, для многофакторных заболеваний, к которым относятся и БГ, и ЭОП, характерна реализация генетической предрасположенности к заболеванию только при наличии определенных комбинаций генотипов и аллелей и пусковых средовых факторов.

Ассоциация с ЭОП обнаружена для полиморфных маркеров ряда генов, кодирующих интерлейкины, трансформирующий β-фактор роста, фактор некроза опухоли (TNF), интерферон-γ (IFN-γ), поверхностный рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) и др. [3—11].

Ген CTLA4 располагается на хромосоме 2q33 и кодирует поверхностный рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов, являющийся негативным регулятором активации Т-клеток. CTLA4 является корецептором на клеточной поверхности, связывающим лиганд B7, который активирует CD28 — важнейший компонент стимуляции Т-лимфоцитов. Поскольку инфильтрация ретробульбарных тканей Т-клетками играет ключевую роль в патогенезе ЭОП, ген CTLA4 может рассматриваться в качестве гена-кандидата, предрасполагающего к развитию ЭОП. Изучение ассоциации полиморфных маркеров гена CTLA4 с риском развития ЭОП являлось предметом нескольких исследований в различных популяциях, в некоторых [12—17], но не во всех исследованиях [18—23] обнаружена ассоциация с ЭОП.

Полученные нами результаты показывают, что у пациентов с БГ и ЭОП в анамнезе достоверно повышены частоты аллеля, А и генотипа АА, но в то же время снижена доля аллеля G и генотипа GG полиморфного маркера rs3087243 гена CTLA4, что может свидетельствовать об ассоциации этого полиморфного маркера с риском развития ЭОП.

Ген TNF кодирует фактор некроза опухоли — ключевой воспалительный цитокин, принимающий участие в патогенезе ЭОП. Роль продукта гена TNF в развитии ЭОП остается неясной. Выявлена ассоциация полиморфного маркера G (–238)A (rs361525) гена TNF c риском развития ЭОП в польской и иранской популяции, а также полиморфных маркеров T (–1031)A и C (–863)A в японской популяции и C (–863)A в китайской [9, 24—26]. В нашем исследовании мы использовали полиморфный маркер G (–308)A (rs1800629) гена TNF, который находится в частичном неравновесии по сцеплению с маркером G (–238)A (rs361525) гена TNF в европеоидной популяции. Полученные нами данные не выявили различий по частоте аллелей и генотипов у пациентов с ЭОП или без ЭОП, не показали ассоциации полиморфного маркера G (–308)A гена TNF с риском развития офтальмопатии. Расхождения с данными литературы могут быть объяснены этническими различиями, поскольку большинство исследований проведено на азиатской популяции.

Таким образом, полученные для русской популяции данные показывают, что с риском развития ЭОП ассоциирован полиморфный маркер rs3087243 гена CTLA4. В русской популяции больных с БГ полиморфный маркер rs1800629 гена TNF не ассоциирован с риском манифестации ЭОП.

Исследование проведено при финансовой поддержке гранта РФФИ (проект № 14−04−31758).

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов в связи с написанием данной статьи.