Введение

В структуре насильственной смерти в Российской Федерации в период с 2013 по 2022 г. средний удельный вес механической асфиксии составил 24,5±1,5%. При этом доля смерти от утопления в среднем по стране составила 28,8±1,5% случаев механической асфиксии [1]. Установление причины смерти в случаях утопления характеризуется сложностью и имеет свою специфику. Зачастую отсутствуют данные об обстоятельствах наступления смерти, вещественные доказательства на месте происшествия малочисленны или вовсе отсутствуют. Кроме того, водная среда способствует быстрому развитию посмертных изменений [2, 3]. В этой связи первостепенное значение имеют обоснованное использование лабораторно-диагностических методов исследования и правильная трактовка полученных результатов. По мнению ряда авторов, диатомовый тест является «золотым стандартом» среди других лабораторных исследований, выполняемых для диагностики смерти в результате утопления [4].

Еще в 1861 г. Guy впервые обратил внимание на факт проникновения объектов водной среды внутрь тела утонувшего, затем в 1896 г. Hofmann обнаружил диатомеи в легких (в легочной жидкости) утонувших. А в 1942 г. G. Incze установил, что в случае утопления диатомовые водоросли способны попадать в системный кровоток и впоследствии обнаруживаться в разных органах, в том числе головном и костном мозге, а также в пазухах основной кости [5]. Проведенные в последующие годы многочисленные исследования, в том числе и экспериментальные, подтвердили ценность диатомей в качестве вспомогательного «инструмента» при экспертной оценке случаев утопления.

Образцы, направляемые для медико-криминалистического исследования, регламентируются соответствующими нормативными актами: «обязательным основным объектом для исследования является невскрытая почка в капсуле с перевязанной “ножкой”, при проведении судебно-медицинской экспертизы гнилостно измененного трупа — трубчатая кость с костным мозгом» (цит. по [6]). Общепринятой схемой очистки и подготовки к микроскопическому исследованию диатомей является кипячение образцов тканей с концентрированной азотной кислотой и последующим центрифугированием или фильтрацией [7].

В настоящее время стали чаще появляться публикации, в которых приведены данные о снижении частоты обнаружения диатомей, а также о ложноотрицательных результатах диатомового теста, проведенного с использованием концентрированных кислот, ввиду того, что последние могут разрушать структуру некоторых видов диатомовых водорослей [8—13].

Цель настоящей работы — систематический обзор исследований, посвященных современным методам экстракции диатомового планктона, сравнительный анализ преимуществ и недостатков этих методов для прогнозирования возможности внедрения в экспертную практику.

Материал и методы

Научные публикации, отвечающие цели работы, были отобраны в январе 2024 г. путем поиска в международной базе PubMed и Springer Link. Поисковый запрос включал следующие фразы: «diatoms in forensic», «diatom extraction», «diatom extraction in forensic», «methods extraction of diatoms», «diatom test». Критериями поиска были обозначены: абстрактные и полнотекстовые статьи, опубликованные за период с 2000 по 2024 г.; язык публикаций — английский, русский. По запросу были найдены 111 работ. При дальнейшем изучении исключены статьи, в которых отсутствовало описание использованной методики.

Результаты и обсуждение

Диатомовый тест оказывает неоценимую помощь судебным медикам в вопросах диагностики причины смерти от утопления. Прослеживается тенденция по увеличению в последние десятилетия количества публикаций, освещающих те или иные методы экстракции диатомового планктона, а также их модификации. Тем не менее подавляющее большинство изученных исследований по-прежнему касается традиционных методик идентификации планктона путем использования агрессивных реактивов, зачастую приводящих к неверной интерпретации.

Вошедшие в настоящую работу публикации были проанализированы и систематизированы в зависимости от методики экстракции диатомового планктона.

Методы с применением неорганических кислот и окислителей

Результаты обзорной работы D. Caeiro (2021), посвященной расщеплению образцов тканей концентрированными кислотами, показывают, что в настоящее время этот метод является наиболее популярным при экстракции диатомей в судебно-медицинских целях, ввиду его относительной простоты и малых временны́х затрат [14]. Несмотря на это, возросшее количество ложноотрицательных заключений требует пересмотра предпочтительных методик идентификации планктона, с учетом нюансов безопасности персонала, проводящего исследования, и экологического загрязнения остаточными отходами.

K. Serieyssol и соавт. (2010) [15] рассмотрели варианты использования азотной кислоты (HNO₃) с дихроматом калия (K₂Cr₂O₇), с перекисью водорода (H₂O₂), а также перманганатом калия (KMnO₄) с 37% H₂O₂, однако преимуществ и недостатков описанных способов экстракции авторами предоставлено не было.

N. Fucci (2012) [16] провел сравнительное исследование методики экстракции с концентрированными кислотами (HNO₃ и серной (H₂SO₄)) и разбавленной серной кислотой (30% H₂SO₄) для образцов тканей легких, печени, головного мозга и почки, изъятых в ходе судебно-медицинского вскрытия утонувших. Результаты показали, что 30% H₂SO₄ сохранила кремнистую структуру планктона и вместе с тем хорошую визуальную составляющую при микроскопическом исследовании, в связи с чем она может быть использована в качестве альтернативы концентрированным кислотам.

M.K. Mishra и соавт. (2013) [17] предложили метод экстракции диатомей с использованием HNO₃ вкупе с KMnO₄ и H₂O₂ в соотношении 4:2:3. По сравнению с традиционным методом (концентрированная HNO₃), данный способ показал более качественные результаты: образцы для последующего микроскопического исследования оказались «чище», сам процесс был более щадящим, а затраченное на данные манипуляции время — меньше.

E. Potaka (2017) [18] провел сравнительный анализ наиболее распространенных методов экстракции диатомей и отметил их недостатки, например, частичное или полное разрушение планктона при воздействии концентрированных кислот. Также было обозначено, что возможно использование H₂O₂ в качестве альтернативы кислотному расщеплению, однако высокие концентрации перекиси аналогично кислотам могут повредить структуру отдельных видов диатомей, с последующими ложноотрицательными заключениями. К наименее пригодным методам в судебно-медицинском отношении E. Potaka отнес ополаскивание образцов тканей водой и этанолом.

C. Widyanta и соавт. (2020) [19] сравнивали методы экстракции диатомового планктона с использованием соляной кислоты (HCl) и H₂O₂ и HCl с KMnO₄. Было показало, что расщепление HCl-H₂O₂ более предпочтительно, т.к. при последующей микроскопии структура диатомей сохранялась и была четче для визуальной оценки.

В исследовании K.S. Mawande (2020) были продемонстрированы методы экстракции планктона с использованием H₂O₂ в нагретом и охлажденном виде [20]. В конечном итоге это дало одинаковые результаты: при микроскопической оценке фрустулы (кремниевый каркас диатомовых водорослей) всех микроорганизмов были без повреждений.

K. Scott и соавт. (2017) подтвердили, что экстракция диатомей с помощью H₂O₂, является наиболее успешной методикой, поскольку при ее применении хорошо растворяются органические соединения, при этом сохраняется целостность кремниевого каркаса [21]. К тому же H₂O₂ на порядок безопаснее и экологичнее привычных кислот. К аналогичным выводам пришли F. Marezza и соавт. (2021), опубликовавшие работу, в которой сравнивали традиционную методику извлечения диатомового планктона при помощи концентрированных кислот с экстракцией путем воздействия на исследуемые препараты H₂O₂ [22].

В 2021 г. S. Tsuneya и соавт. оценили эффективность применения гипохлорита натрия (NaClO) в качестве альтернативы кислотному расщеплению концентрированной HNO₃ [23]. Ими были использованы 32 образца легких погибших людей в результате утопления, которые подвергались воздействию NaClO и HNO₃. Количественная разница обнаруженных диатомей оказалась меньше при выдержке в растворе NaClO, но не статистически значимой. Из этого следует, что NaClO может быть использован вместо традиционной HNO₃ из соображений безопасности, ввиду отсутствия воспламеняющих свойств.

S. Chakraborty [24] в январе 2024 г. опубликовала исследование, также направленное на сравнительную оценку методов экстракции при помощи концентрированной HNO₃ и 30% H₂SO₄. Было отмечено, что при использовании концентрированной HNO₃ немалое количество планктона оказалось либо с разрушенной либо с поврежденной структурой, в то время как после воздействия 30% H₂SO₄ большинство планктона было интактным. Также автор сделала вывод о том, что диатомовый тест на основе расщепления тканей разбавленной H₂SO₄ является более предпочтительным и повсеместное его внедрение в судебно-медицинскую практику взамен традиционному на порядок снизит процент ложноотрицательных результатов.

Методы ферментативного расщепления

T. Takeichi и соавт. (2009) изучали применение протеиназы K для идентификации диатомового планктона в медико-криминалистической практике [25]. Объектом их исследования были формалин-фиксированные и нефиксированные образцы легких, полученные в результате аутопсии жертв утопления. Образцы нагревали в буферном растворе, содержащем глицин, затем полученный раствор подвергали ферментативному расщеплению протеиназой К. Разделение образцов на две группы было проведено с целью установить, возможно ли длительное сохранение диатомей в архивных гистологических препаратах. Результаты показали, что фиксация формалином не только сохраняет изначальное количество планктона в образцах тканей, но и препятствует попаданию микроорганизмов извне. Причем фиксированные образцы, при последующей микроскопической оценке, оказались визуально более пригодными (изображения диатомей были более четкими). Помимо этого, данный метод более безопасен, в сравнении с кислотным расщеплением. Однако неполное переваривание органических компонентов может затруднить микроскопию, что повлияет на результат. Также дороговизна и большее количество времени, требующееся для расщепления, по сравнению с HNO₃ и H₂O₂, являются недостатками данного этого исследования.

Применение папаина в качестве реагента при экстракции диатомей из тканей легких, печени и почек, нашло свое отражение в исследовании E. Kakizaki и соавт. (2019) [26]. За счет хорошей термолабильности, использование папаина возможно при температуре 50—70 °C в течение 3—5 ч. Папаин является хорошей альтернативой кислотной экстракции, т.к. сохраняет структуру планктона. Помимо этого, он экологичен и безопасен для специалистов. Также он более выгоден с финансовой точки зрения по сравнению с методом расщепления с помощью протеиназы K.

Молекулярные методы

В дополнение к основным методам экстракции диатомей, ряд авторов предлагают использовать методики, основанные на ДНК-анализе. В мировой практике именно молекулярный подход, благодаря своей высокой специфичности, становится все более популярным и эффективным [27].

Так, E. Racz и соавт. (2016) [28] путем диагностики с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) извлекли ДНК диатомового планктона из образцов тканей селезенки у погибших в результате утопления, в то время как стандартные диатомовые тесты были отрицательны. Ранее T. Uchiyama и соавт. (2012) [29] по данным ПЦР-исследования тканей почек и печени 32 погибших в результате утопления обнаружили фрагменты планктона в 84% случаев, когда традиционные диатомовые тесты были положительными лишь в 44% случаев. Также с применением ПЦР можно обнаружить диатомовый планктон в сложных случаях утопления с малым содержанием организмов, когда микроскопия может и вовсе их не выявить, что значительно улучшает точность постановки посмертного диагноза.

В том же году E. Kakizaki и соавт. (2012) [30] применили технологию 454-пиросеквенирования 16S рибосомальной РНК в качестве вспомогательного метода идентификации диатомового планктона, обладающей высокой достоверностью, по сравнению с привычным диатомовым тестом.

Также E. Kakizaki и соавт. (2018) [31] методом LAMP (петлевая изотермическая амплификация) проводили идентификацию планктона в исследовании, включающем 72 образца легочной ткани. Продемонстрировано, что за довольно короткий временной промежуток (от 30 мин до 1,5 ч) представилась возможность обнаружить ДНК планктона и диагностировать причину смерти от утопления. Тест LAMP менее трудоемкий и менее финансово затратный в условиях логистических и кадровых ограничений; также он может быть использован в качестве дополнительного метода подтверждения утопления.

N. Idota и соавт. (2018) [32] в качестве метода обнаружения диатомей предложили температурно-градиентный гель-электрофорез (TGGE). Авторы с посощью TGGE выделили рибосомную ДНК планктона из смывов полостей сердца и печени 27 трупов. TGGE, по данным авторов, явно превосходит привычное расщепление тканей по затраченному на исследование времени и степени безопасности.

Молекулярные методы используют не только с целью диагностики (обнаружения), но и для идентификации видового состава. Наиболее распространенным является метод штрихкодирования видовой ДНК. ДНК извлекают из образца диатомовой водоросли, амплифицируют с использованием ПЦР, затем амплифицированную ДНК секвенируют и сравнивают с видами из библиотеки данных. В настоящее время для секвенирования и эпигенетического анализа используют платформы NGS (next-generation sequencing, секвенирования нового поколения). Для идентификации диатомей посредством обнаружения и визуализации последовательности нуклеиновых кислот предлагается использовать флуоресцентную гибридизацию in situ (FIS) [33]. Помимо этого, для распознавания и идентификации диатомей в современных исследованиях активно используют методы и приемы искусственного интеллекта: компьютерное зрения для анализа изображений и алгоритмы машинного обучения для классификации.

Другие методы

Используя метод центрифугирования коллоидного кремнезема, взамен кислотного расщепления, Ç. Erkan и соавт. (2019) [34] проводили диатомовые тесты на образцах тканей (печени, головного и костного мозга, легких, почек и др.), полученных аутопсийным путем от 30 трупов, извлеченных из воды. К препаратам тканей добавляли по 1 мл дистиллированной воды, а затем — по 8 мл перколла (изоосмотического сорбента). Предложенный метод надежен и экологичен, а также прост в применении.

В 2020 г. Y. Zhou и соавт. [35] был рассмотрен современный метод, в котором уже устоявшееся расщепление концентрированными кислотами было заменено на микроволновое расщепление тканей с последующей вакуумной фильтрацией и микроскопией (MD-VF-Auto SEM). Авторы сообщили о том, что MD-VF-Auto SEM позволяет сохранить изначальное количество диатомей в полном объеме. Помимо этого, авторы обобщили разные методики экстракции диатомового планктона и подтвердили риски получения ложноотрицательных результатов диатомового теста при использовании сильных кислот.

Метод сухого озоления предполагает использование муфельной печи (500—600 °C), при нахождении в которой неорганические вещества, вода и летучие вещества из исследуемых образцов испаряются, а органические вещества сгорают в присутствии O₂ с образованием CO и оксидов азота [36].

Заключение

Согласно отчетам Всемирной организации здравоохранения (2021), от утопления в мире ежегодно умирает приблизительно 230 тыс. человек [1]. Аутопсийные признаки наступления смерти в результате погружения в воду не всегда объективны, ввиду быстрого развития гнилостных изменений. Диатомовый тест, ставший «золотым стандартом» при диагностике утоплений, с течением времени претерпел некоторые изменения, касающиеся преимущественно совершенствования методик проведения экстракции планктона из образцов исследуемых тканей посредством использования современного оборудования (микроволновое расщепление, вакуумная фильтрация, электронная микроскопия высокого разрешения и др.). Связано это с тем, что надежность альгологического исследования подвергалась и подвергается сомнению, в том числе и с наличием ложноположительных результатов, и с низкой чувствительностью теста при небольшой концентрации диатомей в водоеме (среде утопления). Ухудшение экологической обстановки, повышение загрязнения окружающей среды, наблюдаемое повсеместно, приводит к обеднению экосистем, что, в свою очередь, может являться причиной отрицательных результатов диатомового теста [9]. Современные исследования направлены на решение данной проблемы. При анализе научных публикаций также становится очевидно, что устоявшиеся традиционные методы не всегда безопасны как для проводящих манипуляции работников, так и для окружающей среды. В связи с вышесказанным, актуальным становится разработка и/или усовершенствование уже существующих методик экстракции диатомового планктона, принимая во внимание достоверность полученных результатов, а также экологичность и безопасность.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.