Ароматическое вещество 2,4,6-тринитрофенол (2,4,6-ТНФ, пикриновая кислота) имеет молекулярную массу 229,11 г/моль. Это светло-желтые кристаллы пластинчатой и призматической формы, без запаха, температура плавления составляет 122 °C (по другим данным, 121,8 или 121,5 °C) [1—4]. 2,4,6-ТНФ имеет умеренную гидрофильность [5]. Так, его растворимость в воде при 20 °C составляет около 14 г/л (по другим данным — 12,7 г/л при 25 °C). В 1 л этанола растворяется 83 г этого вещества [4, 6]. 2,4,6-ТНФ растворим в бензоле (100 г/л), хлороформе (28 г/л), диэтиловом эфире (15 г/л), легко растворим в ацетоне [3].
Известно применение 2,4,6-ТНФ в качестве желтого красителя, бризантного взрывчатого вещества [7, 8], реактива при химическом анализе, для травления магниевых сплавов и в оптической металлографии, как окислителя при обработке кожи, в качестве катализатора при синтезе полимеров, в качестве составного компонента раствора Ван Гизона в гистологии [9, 10]. Это вещество способно проникать в организм человека ингаляционным путем наряду с возможностью перкутанного или перорального проникновения [1, 2].
При местном воздействии 2,4,6-ТНФ возможно раздражение слизистых оболочек глаз, верхних дыхательных путей. При длительном или повторяющемся воздействии его на кожу развивается контактный дерматит. При постоянном контакте с 2,4,6-ТНФ развивается хроническое отравление, вещество оказывает мутагенное, онкогенное и тератогенное влияние на организм [2, 7]. Системными эффектами соединения являются окрашенные в желтый цвет кожа и волосы, усталость (слабость, истощение), миалгия, анурия, полиурия, горький привкус во рту, расстройства желудочно-кишечного тракта, гепатит, гематурия, альбуминурия и нефрит [11].
Известны токсические дозы этого вещества для некоторых животных. Так, минимальная летальная доза (МЛД) при пероральном введении для кошек составляет 250 мг/кг, для морских свинок — 100 мг/кг. Для собак вещество представляет большую опасность, поскольку для них МЛД равна всего 60 мг/кг. Показатель LD50 для крыс равен 200 мг/кг. При отравлении людей полинитрофенолами, к которым относится и 2,4,6-ТНФ, возможны летальные исходы [12—14]. Несмотря на широкое и разнообразное применение 2,4,6-ТНФ, его токсичность, выявленные факты отравлений, в том числе со смертельным исходом, многие химико-токсикологические характеристики вещества остаются малоизученными.
Цель исследования — изучение распределения 2,4,6-ТНФ у теплокровных животных с использованием физико-химических методов анализа после внутрижелудочного введения токсиканта.
Материал и методы
В качестве объекта исследования была использована субстанция 2,4,6-ТНФ (P0CHBN-72/6193-32, Польша) с концентрацией примесей не более 1%.
Моделью теплокровных организмов были выбраны самцы крыс линии Wistar в возрасте около 4 мес. В эксперименте были задействованы 30 крыс (средняя масса 250—350 г). Подопытные животные были разделены на 6 групп по 5 представителей в каждой (5 опытных и 1 контрольная группа). Каждой крысе внутрижелудочно (при помощи зонда) вводили по 600 мг 2,4,6-ТНФ на 1 кг массы тела животного (примерно тройная средняя летальная доза) в виде масляных растворов. Гибель животных наступала в течение 80—120 мин.
Трупы подопытных вскрывали, из них извлекали внутренние органы с содержимым, кровь и мышечную ткань. Одинаковые биологические материалы, полученные от крыс из одних и тех же групп, объединяли. Объединенные пробы измельчали, перемешивали.
Если масса объединенной пробы не превышала 20 г, ее целиком использовали для исследования. Если масса значительно превышала 20 г, то из нее отбирали на исследование 10 г [15—17]. Проводили определение содержания 2,4,6-ТНФ в полученных аналитических пробах. Параллельно осуществляли контрольное определение.
Изолирование. Аналитическую пробу взвешивали, к ней добавляли первую порцию изолирующего агента (смесь ацетон—ацетонитрил в соотношении 1:1). Объем добавляемого изолирующего агента вдвое превышал массу биологического материала. Смесь настаивали в течение 30 мин, перемешивая каждые 8—10 мин. Первое извлечение сливали в индивидуальную пробирку. К аналитической пробе добавляли вторую порцию экстрагента, процесс изолирования повторяли. Извлечения перемешивали и удаляли экстрагент, продувая над ним воздух комнатной температуры. Остаток растворяли в 4 мл ацетона.
Очистка. На пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ наносили 0,1 мл (пластина №1) и 0,8 мл (пластина №2) ацетонового раствора в форме полос площадью около 4×1 см. Наносимые объемы обеспечивают в подготовленных к анализу методами спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) растворах концентрации аналита, в одинаковое количество раз превосходящие концентрации, соответствующие пределам обнаружения 2,4,6-ТНФ с помощью этих методов. Отдельно на каждую из пластин в форме пятна диаметром 3—4 мм наносили 5—10 мкл 0,1% этанольного раствора 2,4,6-ТНФ-стандарта. Хроматографировали, применяя подвижную фазу ацетон—хлороформ (7:3), в камерах из стекла объемом около 0,6 дм3.
После высушивания хроматограмм и их проявления (электромагнитное излучение с длиной волны 254 нм) пятна, соответствующие 2,4,6-ТНФ, вырезали. Вещество элюировали из фрагментов, вырезанных из пластин №1 и №2 соответственно, 5 мл диметилформамида (ДМФА) и 5 мл этанола в течение 10 мин. Применение ДМФА обеспечивает наибольшую интенсивность поглощения аналита и характерную форму спектра, позволяющую отличить данное соединение от ряда близких по структуре полинитрофенолов при спектрофотометрическом определении. Использование этанола позволяет легко испарить элюат до сухого остатка, который растворяют в подвижной фазе для дальнейшей идентификации методом ВЭЖХ.
Идентификация с применением метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). 2,4,6-ТНФ идентифицировали одновременно с процессом очистки методом ТСХ по значению абсолютного коэффициента подвижности (Rf).
Идентификация с применением метода спектрофотометрии. Для идентификации аналита с помощью прибора СФ-2000 определяли спектр диметилформамидного элюата из хроматограммы (пластина №1). При положительном результате спектр характеризовался наличием максимумов поглощения при 379±2 и ≈435 нм (скрытый экстремум).
Идентификация методом ВЭЖХ. Элюат из хроматограммы (пластина №2) испаряли в токе воздуха комнатной температуры. Остаток обрабатывали 0,4 мл ацетонитрила, к раствору прибавляли 1,6 мл воды. Отбирали 16 мкл этого раствора для определения с помощью прибора Милихром-1 («Научприбор», Орел, Россия) с УФ-детектором в колонке 64×2 мм типа КАХ-4. Как сорбент использовали 5 мкм Сепарон С-18. Элюент (вода—ацетонитрил (8:2)) подавали со скоростью 3 мл/ч. Масштаб регистрации составлял 0,4 ед. о.п., длина волны для измерения — 356 нм. Определение также может быть проведено с использованием приборов Милихром-4 или Милихром-5. В случае применения прибора Милихром-1 движение диаграммной ленты осуществляли со скоростью 720 мм/ч. Аналит идентифицировали по свойственному для него времени удерживания (tR), совпадающему со временем удерживания стандарта.
Количественное определение. Оценивали интенсивность поглощения диметилформамидных элюатов с применением спектрофотометра СФ-2000 при 379 нм. Элюат, полученный в ходе проведения контрольного опыта, использовали как фоновую жидкость. Измерение проводили в кюветах из кварца с толщиной поглощающего слоя 1 см. Исходя из этих данных, рассчитывали содержание 2,4,6-ТНФ при помощи уравнения градуировочного графика.
Результаты и обсуждение
При определении по методу ТСХ 2,4,6-ТНФ имел вид ярко-желтых пятен с Rf=0,75±0,03, что совпадало с Rf стандарта (0,75±0,02).
Спектры поглощения, полученные при исследовании растворов 2,4,6-ТНФ в ДМФА (рис. 1), имели две взаимоперекрывающиеся полосы поглощения в диапазоне от 300 до 570 нм. У более коротковолновой и одновременно более интенсивной из них максимум поглощения (379 нм) был четко различимым. У более длинноволновой и менее интенсивной полосы отмечался скрытый максимум, располагающийся приблизительно в области 435 нм. В целом особенности этого спектра являются достаточно специфичными и позволяют идентифицировать 2,4,6-ТНФ спектрофотометрическим методом. Высокая интенсивность более коротковолновой полосы делает возможным количественное определение аналита по интенсивности поглощения его диметилформамидного раствора в области 379 нм.
Рис. 1. Спектры поглощения 2,4,6-тринитрофенола в среде ДМФА.
а: 1 — спектр поглощения вещества, изолированного из содержимого желудка; 2 — стандартного образца; 3 — вещества, изолированного из ткани желудка; 4 — вещества, изолированного из крови; 5 — вещества, изолированного из скелетных (бедренных) мышц; 6 — вещества, изолированного из легких; б: 1 — вещества, изолированного из тонкого кишечника с содержимым; 2 — вещества, изолированного из сердца; 3 — вещества, изолированного из почек; 4 — вещества, изолированного из печени; 5 — вещества, изолированного из селезенки.
Спектры поглощения растворов, полученных при работе с извлечениями из биоматриц, соответствовали спектрам поглощения 2,4,6-ТНФ-стандарта по форме спектральных линий (см. рис. 1).
Вычисленное для 2,4,6-ТНФ-стандарта уравнение градуировочного графика представлено в следующем виде:
A=0,07504∙С+0,00094.
При исследовании методом ВЭЖХ время удерживания 2,4,6-ТНФ в заданных условиях проведения процесса составляло 3,08 мин. Время удерживания несорбируемого компонента — 1,68 мин. При введении аналита в виде раствора в подвижной фазе пик растворителя был слабо выражен и обычно не выходил за пределы 3—5-кратной интенсивности дрейфа базовой линии. Несорбируемые компоненты биоматрицы мало влияли на результаты идентификации 2,4,6-ТНФ в предлагаемых условиях, так как их поглощение в ультрафиолете соответствует области 190—300 нм, в то время как аналитическая длина волны, рекомендуемая для определения 2,4,5-ТНФ, равна 356 нм. Предел обнаружения 2,4,6-ТНФ — 0,02 мкг в элюируемой пробе.
На рис. 2 представлены хроматограммы аналита, извлеченного из биоматриц, и 2,4,6-ТНФ-стандарта, демонстрирующие совпадение значений их времени удерживания (tR).
Рис. 2. Хроматограммы (метод ВЭЖХ) 2,4,6-тринитрофенола.
1 — хроматограмма вещества, изолированного из содержимого желудка; 2 — стандартного образца; 3 — вещества, изолированного из ткани желудка; 4 — вещества, изолированного из крови; 5 — вещества, изолированного из скелетных (бедренных) мышц; 6 — вещества, изолированного из легких; 7 — вещества, изолированного из тонкого кишечника с содержимым; 8 — вещества, изолированного из сердца; 9 — вещества, изолированного из почек; 10 — вещества, изолированного из печени; 11 — вещества, изолированного из селезенки.
При оценке извлечений из биоматриц крыс контрольной группы аналит не обнаруживался. При 379 нм (спектрофотометрия) оптическая плотность контрольного диметилформамидного элюата из зоны сорбента, соответствующей расположению пикриновой кислоты, не выходила за пределы 0,016 единицы (фоновое поглощение, обусловленное остатками эндогенных соединений, извлеченных из 1 г биоматрицы и присутствующих в 1 мл элюата). При 356 нм (ВЭЖХ) фоновое поглощение, обусловленное остатками эндогенных соединений, извлеченных из 1 г биоматрицы и присутствующих в 1 мл смеси ацетонитрил—вода (2:8), не выходило за пределы 0,018.
Данные, отражающие характер распределения 2,4,6-ТНФ у теплокровных животных (на примере крыс), отравленных путем введения в желудок трехкратной полулетальной дозы рассматриваемого токсичного вещества, внесены в таблицу.
Результаты определения 2,4,6-тринитрофенола (2,4,6-ТНФ) в организме теплокровных животных (крысы)
| Биологический объект (орган или биожидкость) | Масса аналитической пробы, г | Найдено 2,4,6-ТНФ | Метрологические характеристики | Биологический объект (орган или биожидкость) | Масса аналитической пробы, г | Найдено 2,4,6-ТНФ | Метрологические характеристики | ||
| мг в исследуемой массе биологического объекта | мг в 100 г биологического объекта | мг в исследуемой массе биологического объекта | мг в 100 г биологического объекта | ||||||
| Содержимое желудка | 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 | 15,947 17,579 14,454 14,141 12,821 | 159,47 175,79 144,54 141,41 128,21 | x=149,88 S=18,26 Sx=8,16 Δx=22,70 | Легкие | 10,75 9,62 11,82 10,39 12,67 | 0,951 0,725 1,122 0,845 1,428 | 8,85 7,54 9,49 8,13 11,27 | x=9,06 S=1,44 Sx=0,64 Δx=1,79 |
| Сердце | 4,88 4,19 3,92 5,01 4,91 | 0,251 0,183 0,164 0,302 0,254 | 5,14 4,37 4,18 6,03 5,17 | x= 4,98 S= 0,74 Sx=0,33 Δx=0,92 | Печень | 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 | 0,437 0,333 0,392 0,411 0,433 | 4,37 3,33 3,92 4,11 4,33 | x=4,01 S=0,42 Sx=0,19 Δx=0,52 |
| Почки | 11,21 12,94 10,38 10,83 11,14 | 0,554 0,661 0,396 0,511 0,542 | 4,94 5,11 3,82 4,72 4,87 | x=4,69 S=0,51 Sx=0,23 Δx=0,63 | Кровь | 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 | 1,613 1,696 1,564 1,582 1,498 | 16,13 16,96 15,64 15,82 14,98 | x=15,91 S=0,72 Sx=0,32 Δx=0,90 |
| Селезенка | 4,31 6,54 4,97 5,05 4,23 | 0,150 0,309 0,184 0,192 0,147 | 3,48 4,72 3,70 3,80 3,48 | x=3,84 S=0,51 Sx=0,23 Δx=0,64 | Желудок без содержимого | 11,23 15,74 15,93 14,13 16,47 | 10,249 15,671 15,960 13,779 16,620 | 91,27 99,56 100,19 97,52 100,91 | x=97,89 S=3,91 Sx=1,75 Δx=4,86 |
| Мышцы (бедренные) | 6,32 6,98 5,88 7,21 5,45 | 0,687 0,820 0,583 0,929 0,488 | 10,87 11,75 9,91 12,88 8,96 | x=10,87 S=1,53 Sx=0,69 Δx=1,91 | Тонкий кишечник с содержимым | 20,17 19,86 21,01 20,73 20,81 | 1,283 1,180 1,588 1,358 1,369 | 6,36 5,94 7,56 6,55 6,58 | x=6,60 S=0,60 Sx=0,27 Δx=0,74 |
На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что исследуемое вещество (мг/100 г) преимущественно обнаруживается в содержимом желудка (149,88±22,70), стенке желудка (97,89±4,86), крови (15,91±0,90) и скелетных (бедренных) мышцах (10,87±1,91). Несколько меньшие количества 2,4,6-ТНФ присутствуют в легких (9,06±1,79 мг/100 г) и тонком кишечнике с содержимым (6,60±0,74 мг/100 г). Достаточно близкий уровень содержания ((3,84–4,98)±(0,52–0,92) мг/100 г) токсиканта фиксируется в селезенке, печени, почках и сердце крыс.
Выводы
1. Исследовано распределение 2,4,6-ТНФ у теплокровных (крыс) после введения тройной средней смертельной дозы (LD50) этого вещества в желудок.
2. Предложена схема определения аналита в биоматрицах на основе изолирования смесью ацетон—ацетонитрил (1:1) и определения методами ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.
3. Выявлено, что токсикант обнаруживается в исходном виде в крови, органах, содержимом желудка и тонкого кишечника, взятых у погибших животных. Биоматрицами, в которых выявлено преимущественное содержание 2,4,6-ТНФ (мг/100 г), явились: содержимое желудка (149,88±22,70), стенка желудка (97,89±4,86), кровь (15,91±0,90) и скелетные мышцы (10,87±1,91).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.