Введение
К веществам, имеющим важное практическое значение, относится 2-амино-4,6-динитрофенол (6-амино-2,4-динитрофенол, 2,4-динитро-6-аминофенол, 1-амино-2-гидрокси-3,5-динитробензол, пикраминовая кислота; далее — 2-А-4,6-ДНФ), который является нитроароматическим соединением (производное фенола) с молекулярной массой, равной 199,12 г/моль [1, 2].
Это вещество представляет собой темно-красные кристаллы игольчатой и призматической формы (из спирта 2-А-4,6-ДНФ кристаллизуется в виде игл, а из хлороформа — в виде призм) без запаха. Кристаллы вещества имеют температуру плавления 169 °C. 2-А-4,6-ДНФ имеет относительно низкую гидрофильность. Так, растворимость в воде при 20 °C составляет менее 1 мг/мл, по другим данным — 65 мг в 100 мл воды (22—25 °C) и 140 мг в 100 мл воды. При этом он растворим в бензоле, диэтиловом эфире, ледяной уксусной кислоте. Вещество хорошо растворяется в диметилсульфоксиде (более 100 г в 1 л воды), а растворимость в этаноле составляет менее 60 г в 1 л воды [1, 3].
Как и многие другие полинитросоединения, 2-А-4,6-ДНФ и его натриевая соль используются в качестве бризантных взрывчатых веществ, красителей при производстве красок для волос (в концентрации до 0,6%), а также красящих шампуней разных оттенков [4, 5].
Кроме того, это соединение применяется в производстве некоторых азокрасителей и высокоэнергетических (взрывчатых) соединений [4, 6—8]. Оно также обладает фунгицидной активностью [9].
Рассматриваемый 2-А-4,6-ДНФ обладает высокой токсичностью для животных при разных путях введения, из которых как наиболее опасный отмечается пероральный. Этот полинитрофенол и его изомер (4-амино-2,6-динитрофенол) являются основными метаболитами 2,4,6-тринитрофенола, также относящегося к высокотоксичным соединениям [10—13].
Выбранный для исследования 2-А-4,6-ДНФ способен вызывать острые и хронические отравления. Так, LD50 для крыс при пероральном введении составляет 110 мг на 1 кг массы животного. При этом отмечается появление симптомов в течение 1—19 ч после введения дозы (вялость, оранжевое окрашивание конечностей и пилоэрекция), а восстановление выживших особей при активном лечении занимает 5 сут. Также характерны изменение цвета печени, бледность почек и селезенки и оранжевое окрашивание внутренней стенки желудка [3, 12, 14]. Установлены токсические дозы вещества, приводящие к острым отравлениям и при других путях введения. Так, минимальная летальная доза (LDLo) 2-А-4,6-ДНФ для голубей при внутрибрюшинном введении составляет 140 мг/кг, для крыс при подкожном введении — 2100 мг/кг [15].
Несмотря на очевидное токсикологическое значение 2-А-4,6-ДНФ, многие вопросы химико-токсикологического анализа этого вещества остаются недостаточно разработанными.
Цель исследования — изучение особенностей определения и характера локализации 2-А-4,6-ДНФ в организме теплокровных животных при летальном отравлении после введения токсиканта в желудок.
Материал и методы
В качестве объекта исследования был рассмотрен 2-А-4,6-ДНФ (CAS №96-91-3) с содержанием основного вещества более 99% (соответствует ТУ 6-10-1269-77).
В качестве подопытных животных использовали 25 самцов крыс 4-месячного возраста породы Wistar массой 250—350 г. Животные были разделены на 5 групп по 5 особей в каждой. Всем крысам внутрижелудочно (при помощи зонда) вводили по 330 мг 2-А-4,6-ДНФ на 1 кг массы тела животного (примерно тройная средняя летальная доза) в виде 3,3 мл 10% масляного раствора. Гибель животных наступала в течение 80—120 мин.
Трупы подопытных животных через 5 мин после наступления смерти вскрывали, из них извлекали внутренние органы, кровь и мышечную ткань. Одинаковые биологические материалы, полученные от крыс из одних и тех же групп, объединяли. Объединенные пробы измельчали, перемешивали. Определенные количества объединенных проб брали для формирования аналитических проб. В случае, если количество объединенной пробы не превышало 20 г, ее полностью использовали в качестве аналитической пробы. Если это количество было более 20 г, то на исследование брали 10 г [16—18].
Выполняли определение содержания 2-А-4,6-ДНФ в полученных аналитических пробах.
Одновременно проводили контрольное исследование на пяти крысах, объединенных в одну группу сравнения.
Изолирование. Каждую из аналитических проб взвешивали, к ней добавляли изолирующий агент (смесь ацетон-ацетонитрил в соотношении 1:1) таким образом, чтобы объем добавляемого изолирующего агента численно в 2 раза превышал массу аналитической пробы.
Полученную смесь настаивали в течение 30 мин, каждые 10 мин перемешивая по 40 с, интенсивность перемешивания составляла 30 об/мин. Извлечение сливали с твердого субстрата, фильтруя в пробирку или колбу. Затем процесс изолирования повторяли после добавления к твердому субстрату новой порции изолирующего агента. Второе извлечение объединяли с первым. Объединенное извлечение перемешивали, переносили в выпарительную чашку и отгоняли экстрагент при помощи потока воздуха комнатной температуры. К сухому остатку приливали 4 мл ацетона и перемешивали до полного растворения остатка.
Очистка. По 0,1 мл ацетонового раствора наносили на линии старта двух (№1 и №2) хроматографических пластин (пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ) в виде полос размерами примерно 4 см длиной и 1 см шириной. В качестве вещества-свидетеля отдельно на линию старта наносили 2-А-4,6-ДНФ-стандарт в виде 5—10 мкл 0,1% этанольного раствора в форме пятен диаметром около 3 мм. Пластины высушивали в течение 3 мин в токе воздуха комнатной температуре и помещали в предварительно насыщенные парами растворителя хроматографические камеры объемом около 0,6 дм3. Хроматографировали при использовании подвижной фазы ацетон—хлороформ (7:3). Затем пластины извлекали из камеры и высушивали.
Пятна, соответствующие 2-А-4,6-ДНФ, вырезали из хроматограмм вместе с подложкой. Вещество из пятен, находившихся на пластинах №1 и №2, элюировали соответственно 5 мл диметилформамида (ДМФА) и 5 мл ацетона в течение 10 мин.
Идентификация с применением метода тонкослойной хроматографии. 2-А-4,6-ДНФ идентифицировали одновременно с процессом очистки методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) по величине абсолютного коэффициента подвижности (Rf).
Идентификация с применением метода УФ-спектрофотометрии. Для идентификации вещества этим методом снимали спектры диметилформамидного элюата (пластина №1) на спектрофотометре СФ-2000 на фоне раствора, полученного в контрольном опыте с группой сравнения. В случае присутствия больших количеств аналита в диметилформамидном элюате последний разбавляли ДМФА. При положительном результате (присутствие 2-А-4,6-ДНФ) полученные спектры характеризовались наличием максимумов поглощения в видимой области при длинах волн 422±2 и 490±2 нм.
Идентификация с использованием метода газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Элюат из хроматограммы (пластина №2) помещали в выпарительную чашу и испаряли растворитель в токе воздуха комнатной температуры.
К сухому остатку приливали 5 мл уксусного ангидрида и кипятили раствор (139 °C). После того как объем растворителя в результате испарения уменьшался до 0,2—0,5 мл, его удаляли в токе азота до сухого остатка. Остаток растворяли в 4 мл этилацетата; 4 мкл полученного раствора вводили в колонку HP-5MS (30 м × 0,25 мм) с иммобилизированной диметилсиллоксановой фазой толщиной 0,25 мкм хромато-масс-спектрометра Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra. Хроматографировали в токе гелия при температуре инжектора 250 °C. Интерфейс детектора работал при температуре 290 °C. Начальная температура термостата колонки (70 °C) поддерживалась в течение 2 мин, затем повышалась до 200 °C со скоростью 40 °C/мин с последующим нагревом до 290 °C со скоростью 12,5 °C/мин и выдерживанием при конечной температуре в течение 2 мин. Скорость газа-носителя составляла 1 мл/мин. Обнаружение проводили в режиме регистрации по полному ионному току с задержкой на растворитель 2,9 мин. Диапазон сканирования составлял 40—600 m/z.
Количественное определение. Измеряли оптическую плотность диметилформамидного элюата при помощи спектрофотометра СФ-2000 в области 490 нм. Элюат, полученный в ходе контрольного опыта, использовали в качестве фоновой жидкости. Измерение проводили в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Количественное содержание 2-А-4,6-ДНФ определяли при помощи уравнения градуировочного графика (10 точек, интервал концентраций 1—18 мкг/мл) с учетом разбавлений.
Результаты и обсуждение
При проведении тонкослойной хроматографии пятно исследуемого вещества на хроматограммах имело коричневато-желтую окраску и характеризовалось величиной абсолютного коэффициента подвижности Rf, равной 0,61±0,04, что соответствовало величине этого же коэффициента вещества-стандарта (0,61±0,03).
Спектры поглощения, полученные при исследовании растворов 2-А-4,6-ДНФ в среде ДМФА (рис. 1), характеризовались двумя интенсивными частично перекрывающимися полосами поглощения в видимой области с максимумами при 422 и 490 нм (значения молярного коэффициента экстинкции соответственно равны 12 635 и 13 335; величины полуширины на половине высоты — 33 и 42). При этом спектры поглощения растворов, полученных при исследовании извлечений из органов и тканей подопытных животных, также соответствовали спектрам поглощения раствора стандарта 2-А-4,6-ДНФ по форме спектральных линий. Характер электронного спектра 2-А-4,6-ДНФ в ДМФА обеспечивал возможность идентификации аналита с достаточной селективностью.
Рис. 1. Спектры поглощения 2-амино-4,6-динитрофенола в среде ДМФА.
а — спектры поглощения: 1 — вещества, изолированного из желудка без содержимого; 2 — вещества, изолированного из содержимого желудка; 3 — вещества, изолированного из сердца; 4 — стандартного образца; 5 — вещества, изолированного из селезенки; б — спектры поглощения: 1 — вещества, изолированного из крови; 2 — вещества, изолированного из тонкого кишечника с содержимым; 3 — вещества, изолированного из почек; 4 — вещества, изолированного из печени; 5 — вещества, изолированного из легких.
Длинноволновая полоса обладала большей интенсивностью и имела пологую вершину, что определяло целесообразность количественного определения аналита по интенсивности поглощения его диметилформамидного раствора в области 490 нм.
По результатам измерений диметилформамидных растворов стандарта 2-А-4,6-ДНФ разной концентрации в области 490 нм было рассчитано уравнение градуировочного графика:
А = 0,066763∙С – 0,007102.
При обработке 2-А-4,6-ДНФ уксусным ангидридом в условиях нагревания при 139 °C получали О-ацетильное производное, структура которого была подтверждена методом протонного магнитного резонанса. Значения времени удерживания ацетильного деривата стандарта 2-А-4,6-ДНФ и аналита, извлеченного из разных органов и крови при идентификации методом ГХ-МС, практически совпадали и находились в интервале 8,07±0,02 мин (рис. 2 и 3). Масс-спектры О-ацетильного производного стандарта аналита и аналита, выделенного из органов отравленных животных, в целом совпадали и содержали совокупность характерных заряженных частиц, приводимых в табл. 1. Предельно обнаруживаемое количество 2-А-4,6-ДНФ методом ГХ-МС по предлагаемой схеме — 0,8 нг в 4 мкл хроматографируемой пробы.
Рис. 2. Хроматограммы (метод ГХ-МС) 2-амино-4,6-динитрофенола.
1 — хроматограмма вещества, изолированного из содержимого желудка; 2 — стандартного образца; 3 — вещества, изолированного из тонкого кишечника с содержимым; 4 — вещества, изолированного из печени; 5 — вещества, изолированного из легких.
Рис. 3. Хроматограммы (метод ГХ-МС) 2-амино-4,6-динитрофенола.
1 — хроматограмма вещества, изолированного из желудка без содержимого; 2 — вещества, изолированного из сердца; 3 — вещества, изолированного из селезенки; 4 — вещества, изолированного из крови; 5 — вещества, изолированного из почек.
Таблица 1. Характеристика масс-спектров О-ацетильного деривата 2-А-4,6-ДНФ, извлеченного из разных биоматриц
| Исследуемый О-ацетильный дериват 2-А-4,6-ДНФ | Набор характеристических ионов, m/z |
| Стандартный образец | 50, 62, 90, 119, 131, 177, 193, 223 |
| Полученный после извлечения аналита из: | |
| печени | 62, 76, 90, 119, 131, 177, 193, 223 |
| содержимого желудка | 53, 62, 78, 90, 131, 193, 207, 223 |
| желудка без содержимого | 52, 62, 78, 90, 119, 131, 193, 223 |
| тонкого кишечника | 50, 62, 76, 90, 119, 131, 177, 223 |
| сердца | 50, 62, 90, 119, 131, 177, 193, 223 |
| почек | 50, 62, 90, 131, 148, 177, 193, 223 |
| легких | 50, 62, 90, 119, 131, 177, 193, 223 |
| крови | 43, 62, 90, 119, 131, 148, 193, 223 |
| селезенки | 62, 78, 90, 119, 131, 177, 193, 223 |
| бедренных мышц | 50, 62, 90, 119, 131, 177, 193, 223 |
При исследовании извлечений из органов и крови крыс контрольной группы, которым введение 2-А-4,6-ДНФ не проводилось, данное вещество рекомендуемыми методами не обнаруживалось. При длине волны 490 нм (является аналитической) оптическая плотность диметилформамидного элюата участка хроматограммы, аналогичного участку локализации пикраминовой кислоты, не превышала 0,015 единиц (фоновое поглощение остатков эндогенных соединений, извлеченных из 1 г биоматрицы и присутствующих в 1 мл элюата).
Конечные данные, характеризующие особенности распределения 2-А-4,6-ДНФ у теплокровных животных (на примере крыс) после внутрижелудочного введения тройной LD50 отравляющего агента, приведены в табл. 2.
Таблица 2. Результаты определения 2-А-4,6-ДНФ в организме теплокровных животных (крысы)
| Биологический объект (орган или биожидкость) | Масса биоматериала, взятая для исследования из суммарного для 5 особей количества биологического объекта, г | Найдено 2-А-4,6-ДНФ | Метрологические характеристики | |
| мг в исследуемой массе биологического объекта | мг в 100 г биологического объекта | |||
| Содержимое желудка | 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 | 13,779 15,296 16,937 12,332 13,223 | 137,791 152,957 169,372 123,324 132,235 | x̄=143,14 S=18,20 Sx̄=8,14 Δx̄=22,63 |
| Сердце | 5,09 5,32 6,17 5,83 5,15 | 1,624 1,723 2,335 2,038 1,563 | 31,911 32,386 37,850 34,954 30,358 | x̄=33,49 S=2,94 Sx̄=1,32 Δx̄=3,66 |
| Почки | 13,50 13,63 12,08 11,85 12,47 | 1,962 2,199 1,759 1,668 1,967 | 14,534 16,134 14,557 14,073 15,777 | x̄=15,02 S=0,89 Sx̄=0,40 Δx̄=1,11 |
| Легкие | 13,15 12,73 10,79 11,13 12,46 | 1,927 1,759 1,276 1,427 1,809 | 14,654 13,815 11,829 12,824 14,520 | x̄=13,53 S=1,20 Sx̄=0,54 Δx̄=1,49 |
| Печень | 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 | 1,337 1,564 1,284 1,714 1,438 | 13,373 15,637 12,842 17,144 14,383 | x̄=14,68 S=1,74 Sx̄=0,78 Δx̄=2,17 |
| Кровь | 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 | 1,756 1,614 1,916 1,952 1,784 | 17,561 16,138 19,159 19,523 17,840 | x̄=18,04 S=1,35 Sx̄=0,61 Δx̄=1,68 |
| Селезенка | 5,75 6,12 5,91 5,67 5,43 | 1,378 1,627 1,393 1,271 1,357 | 23,964 26,582 23,575 22,410 24,989 | x̄=24,30 S=1,57 Sx̄=0,70 Δx̄=1,96 |
| Желудок без содержимого | 11,03 12,45 12,32 13,44 13,98 | 19,686 22,550 26,534 26,509 31,420 | 178,480 181,127 215,372 197,243 224,748 | x̄=199,39 S=20,46 Sx̄=9,15 Δx̄=25,43 |
| Тонкий кишечник с содержимым | 18,11 19,53 20,47 18,93 19,18 | 2,843 3,762 4,106 3,007 3,285 | 15,697 19,262 20,057 15,884 17,128 | x̄=17,61 S=1,97 Sx̄=0,88 Δx̄=2,45 |
Согласно полученным результатам, 2-А-4,6-ДНФ (мг/100 г) в наибольшем количестве определялся в желудке без содержимого (199,39±25,43) и в содержимом желудка (143,14±22,63). Среди прочих биоматриц наибольшее количество исследуемого токсического вещества было обнаружено в сердце (33,49±3,66) и скелетных (бедренных) мышцах (30,70±2,64), а также значительное количество найдено в селезенке (24,30±1,96). В почках, легких, печени, тонком кишечнике и крови 2-А-4,6-ДНФ распределяется практически равномерно, обнаруженное количество колеблалось в интервале 13,53—18,04±1,11—2,45 мг на 100 г биоматериала.
Выводы
1. Изучен характер локализации 2-А-4,6-ДНФ в органах и крови теплокровных животных (крыс), отравленных посредством внутрижелудочного введении тройной средней летальной дозы данного соединения.
2. Разработана схема определения 2-А-4,6-ДНФ в биоматериале на основе изолирования смесью ацетон-ацетонитрил (1:1), идентификации методами спектрофотометрии и ГХ-МС (в виде О-ацетильного деривата) и количественного определения спектрофотометрическим методом. Проведена валидация по критериям линейности, селективности, правильности, прецизионности.
3. 2-А-4,6-ДНФ обнаруживался в неизменном виде в крови и во всех исследованных полых и паренхиматозных органах отравленных крыс. Наибольшее количество токсиканта (мг/100 г) найдено в стенках желудка (199,39±25,43), его содержимом (143,14±22,63), сердце (33,49±3,66) и скелетных мышцах (30,70±2,64).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.