Результаты экспериментального применения антител к TGFβ1 для иммуногистохимической оценки прижизненности повреждений

Проблема достоверной диагностики прижизненности и давности механических повреждений остается одной из наиболее актуальных в судебной медицине. Методы классической судебно-медицинской гистологии, основанные на определении этапов воспалительно-репаративного процесса и широко применяемые на сегодняшний день, обеспечивают приемлемую достоверность начиная с получаса после причинения повреждения, когда определяемые морфологические признаки начинают носить однозначно прижизненный характер. Интервал времени в пределах первых 30—40 мин между причинением повреждения и наступлением смерти традиционно является проблемным, поскольку реакции этого периода, выявляемые преимущественно на тканевом уровне, зачастую обнаруживаются и в посмертном материале.

К настоящему времени в литературе известны приблизительно два десятка иммуногистохимических (ИГХ) маркеров, которые были исследованы на предмет возможности диагностики прижизненности и давности повреждений ИГХ-методами, с помощью которых можно проследить реакцию тканей на повреждение на клеточном и молекулярном уровнях. Тем не менее проблема достоверного определения прижизненности и давности повреждений, особенно на малых интервалах времени от причинения травмы до наступления смерти, не нашла уверенного научного и практического решения. Так, рекомендации по ИГХ-диагностике прижизненности в экспертной практике отсутствуют за редкими исключениями, касающимися отдельных видов повреждений, например, огнестрельной травмы и странгуляционной асфиксии [1, 2].

Сведения об описанных в специальной литературе маркерах прижизненности и ранней (до 30 мин) давности повреждений обобщены и проанализированы ранее в обзорных работах [3—5]. Наибольший интерес представляют маркеры, обнаружение которых возможно уже с первых минут существования повреждения и которые таким образом могут указывать на прижизненность травмы. Одним из таких ранних маркеров прижизненности является трансформирующий фактор роста TGFβ1, который был выбран для проведения настоящего исследования.

TGFb — семейство из 5 пептидных факторов, из которых в организме млекопитающих присутствуют TGFb1—3; в свою очередь, из них превалирует TGFβ1, который является многофункциональным цитокином, оказывающим значительное влияние на ряд физиологических и патологических процессов. TGFβ1 представляет собой мощный ингибитор пролиферации клеток и индуктор апоптоза, контролирующий баланс между репликацией и гибелью клеток. Участие TGFβ1 проявляется в регенеративных (заживление повреждений мягких тканей, органов и костей) и неопластических процессах, развитии фиброза.

TGFβ1 участвует в органогенезе эмбриона, кроветворении, хондро-, адипо- и ангиогенезе, формировании кожи. Действие TGFβ1 зависит от типа клетки-мишени; так, он стимулирует пролиферацию некоторых клеток мезенхимального происхождения (звездчатых клеток печени, фибро- и остеобластов, шванновских клеток, ингибирует рост эпителиальных, эндотелиальных, гемопоэтических (включая мегакариоциты) клеток, кератиноцитов, гепатоцитов [6—8], подавляет активность Т- и В-лимфоцитов [9].

В патологоанатомических исследованиях показана роль TGFβ1 в процессах фиброза при ряде хронических заболеваний. При панкреатитах экспрессия TGFβ1 в поджелудочной железе (особенно в клетках островкового аппарата) способствует прогрессированию фиброза [10]. Аналогичным является воздействие TGFβ1 на структуры печени при аутоиммунных заболеваниях, в частности, аутоиммунном гепатите и первичном билиарном циррозе [11]. Экспрессия TGFβ1 достоверно понижается в эпителии желудка и двенадцатиперстной кишки при развитии гастритов и язвенных поражений, ассоциированных с Helicobacter pylori [12]; увеличение экспрессии TGFβ1 в эпителии отмечено при воспалительных заболеваниях кишечника, сопровождающихся фиброзом [13]. Резистентность к сигналам TGFβ1 рассматривается в качестве одного из факторов канцерогенеза при раке желудка и толстой кишки [14]. Исследуется роль TGFβ1 в канцерогенезе опухолей кожи [15].

Возможность использования TGFβ1 для целей судебно-медицинской диагностики прижизненности одними из первых изучили W. Grellner и соавт. [16], которые на материале из 125 образцов кожных ран и контрольных образцов показали, что гиперэкспрессия TGFβ1 в некоторых структурах кожи, особенно в области кровоизлияний, достигала максимума в течение 30 мин, начинаясь с первых минут после их причинения, примерно в 1/3 повреждений.

T. Kondo и Y. Ishida [17] в своей работе положительно высказываются о возможности использования TGFβ1 для оценки прижизненности повреждений; в качестве перспективного метода авторы рассматривают определение экспрессии нескольких маркеров одновременно, т. е. использование панели антител.

G. Gauchotte и соавт. [18] провели обзор, в котором также рассмотрели TGFβ1 как один из наиболее перспективных потенциальных маркеров. F. Van de Goot и J. Fronczek [19] включили TGFβ1 и P-селектин в число представляющих интерес маркеров в руководство по аутопсийной практике (в главу, посвященную вопросам прижизненности и давности повреждений).

Авторами проведено исследование с антителами к TGFβ1, явлющееся продолжением ранее начатой экспериментальной работы [5] по изучению ИГХ-маркеров прижизненности и ранней давности повреждений.

Использовали предназначенные для научных целей моноклональные антитела Anti-TGF beta 1 antibody TB21 (ab190503, Abcam) с системой визуализации Ventana ultraView Universal DAB Detection Kit, с разведением коммерческого раствора антитела 1:200, инкубацией в течение 2 ч при комнатной температуре и pH=6. Протокол ИГХ-окрашивания разработали предварительно путем подбора параметров, используя в качестве контрольного материала образцы инвазивной протоковой карциномы молочной железы.

Исследовали образцы кожи от 12 трупов лиц (7 мужчин и 5 женщин в возрасте 24—49 лет) с механическими повреждениями, образовавшимися вследствие падения с большой высоты или рельсовой травмы и обусловившими наступление смерти в течение ближайших минут после травмы, что было во всех случаях подтверждено характером и объемом повреждений (массивные разрушения головного мозга, разрывы крупных артериальных сосудов).

Фрагменты кожи с прижизненными кровоподтеками, а также контрольные (без повреждений и с посмертно причиненными повреждениями) от каждого исследованного лица получали в ходе судебно-медицинского исследования трупа в течение первых суток после наступления смерти. Образцы немедленно помещали в 10% нейтральный забуференный формалин на 1—2 сут, после чего проводили дорезку материала, подвергали его стандартной гистологической обработке и заливке в парафин. Из полученных парафиновых блоков изготовили 72 среза, из которых 36 окрашивали гематоксилином и эозином, 36 — ИГХ-методом с антителами к TGFβ1 согласно разработанному протоколу.

Таким образом получили 3 группы срезов (по 24 образца в каждой группе): образцы с прижизненными повреждениями (основная группа); контрольная группа с посмертными повреждениями; контрольная группа без повреждений. В каждой группе 12 срезов были окрашены гематоксилином и эозином, 12 — ИГХ-методом с антителами к TGFβ1.

При исследовании полученных гистологических микропрепаратов кожи из области прижизненных повреждений во всех 12 случаях обнаружены отек дермы и подкожной клетчатки, очаговый спазм мелких артерий, полнокровие, дистония и паретическое расширение мелких вен, очаговые кровоизлияния без перифокальной клеточной реакции в подкожной клетчатке и дерме, что дополнительно свидетельствовало о небольшой давности причинения повреждений.

В некоторых микропрепаратах из области посмертных повреждений обнаружены признаки спазма отдельных мелких артерий, полнокровие и дистония мелких вен; отмечено наличие слабо выраженных мелкоочаговых кровоизлияний в дерме.

С помощью ИГХ-метода в экспериментальных образцах (прижизненные повреждения) выявлена выраженная цитоплазматическая экспрессия TGFβ1 в кератиноцитах эпидермиса (см. рисунок, а, на цв. вклейке). В контрольных образцах кожи — как с посмертными кровоизлияниями, так и без повреждений — экспрессия TGFβ1 в кератиноцитах или не отмечалась, или была очень слабой и локализовалась лишь в некоторых клетках базального слоя (см. рисунок, б, на цв. вклейке).

Результат ИГХ окрашивания с TGFβ1.

а — эпидермис в области прижизненного повреждения, б — эпидермис в области посмертно причиненного повреждения. Ув. 400.

Имеющиеся к настоящему времени научные данные о значении TGFβ1 в развитии тканевых процессов, связанных с репарацией и фиброзом, позволяют считать, что полученные результаты закономерно основаны на роли и механизме действия TGFβ1 в заживлении повреждений.

Первичный синтез TGFβ1 осуществляется преимущественно кератиноцитами и дендритными клетками кожи, тромбоцитами, макрофагами и моноцитами, лимфоцитами, фибробластами. Неактивная форма TGFβ1, связанная с белками LAP (latency-associated peptide, латентно-ассоциированный белок) и LTBP-1 (latent transforming growth factor — binding protein 1, латентный белок, связывающий TGF), хранится в гранулах тромбоцитов или на поверхности клеток. Таким образом, LAP и LTBP «маскируют» эпитопы TGFβ1, и его активная форма практически не обнаруживается в крови и тканях (независимо от метода).

Высвобождение TGFβ1 из неактивного комплекса происходит во время его протеолиза под влиянием различных факторов, в частности плазмина и тромбина, преимущественно при повреждении экстрацеллюлярного матрикса. В острых воспалительно-репаративных процессах синтез и активность TGFβ1 прекращаются после восстановления поврежденной ткани, в хронических наблюдается устойчивая продукция TGFβ1, что приводит к прогрессирующему фиброзу, образованию гипертрофированных и келоидных рубцов. TGFβ1 обладает провоспалительными свойствами (например, служит хемоаттрактантом для последующей миграции в рану лейкоцитов, макрофагов и фибробластов, стимулирует высвобождение некоторых интерлейкинов. В процессе заживления повреждений TGFβ1 выступает как мощный индуктор синтеза коллагена типа I, II, III, V, VI, X и фибронектина, обладает профиброгенным действием посредством стимуляции синтеза мезенхимальных клеток и фибробластов [6].

В дальнейших экспериментальных исследованиях необходимо уточнить интервал времени от момента причинения повреждения, в течение которого в кератиноцитах начинает определяться экспрессия TGFβ1, обеспечить достоверность положительных и отрицательных результатов путем проведения надлежащего количества экспериментов, а также изучить локализацию экспрессии по слоям эпидермиса, что позволит, в случае достижения указанных целей, обосновать практические рекомендации по применению ИГХ-метода определения TGFβ1 для оценки прижизненности повреждений.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.