Выявление некоторых маркеров ранней фазы воспалительно-репаративного процесса при механических повреждениях кожи

Определение этапов воспалительно-репаративного процесса является классическим методом судебно-медицинской гистологии, применяемым для оценки прижизненности и давности механических повреждений мягких тканей. Основной недостаток данного метода — его недостаточная достоверность в отношении повреждений малой (до 30 мин) давности, когда имеющиеся признаки не носят однозначно прижизненный характер в силу известного явления переживаемости тканей.

Изучение данных литературы привело нас к отбору ряда перспективных иммуногистохимических (ИГХ) маркеров для проведения собственных экспериментов по диагностике прижизненности повреждений [1—3]. Ранее мы проводили предварительное исследование с антителами к трансформирующему фактору роста бета 1 (TGF-β1) на небольшом объеме материала и получили перспективные результаты.

Цель настоящей работы — проведение серийных экспериментов с антителами к TGF-β1 с оценкой достоверности полученных результатов, а также пилотного исследования возможности диагностики прижизненности повреждений путем определения плотности дермальных тучных клеток, маркированных с помощью ИГХ-метода антителами к триптазе.

Исследовали образцы кожи от 29 трупов (17 мужчин и 12 женщин в возрасте 22—49 лет) лиц с механическими повреждениями, образовавшимися вследствие падения с большой высоты или рельсовой травмы и обусловившими наступление смерти в течение ближайших минут после травмы, что было во всех случаях подтверждено характером и объемом повреждений (массивные разрушения головного мозга, разрывы крупных артериальных сосудов).

Фрагменты кожи с прижизненными кровоподтеками, а также контрольные образцы (без повреждений и с посмертно причиненными повреждениями) от каждого исследованного лица получали в ходе судебно-медицинского исследования трупа в течение 1-х суток после наступления смерти (87 объектов). Образцы немедленно помещали в 10% нейтральный забуференный формалин на 1—2 сут, после чего проводили дорезку материала, подвергали его стандартной гистологической обработке и заливке в парафин. Объекты разделили на три группы: образцы с прижизненными повреждениями (1-я группа; 29 образцов), контрольная группа без повреждений (2-я группа; 29 образцов), контрольная группа с посмертными повреждениями (3-я группа; 29 образцов).

Для выявления TGF-β1 использовали предназначенные для научных целей моноклональные антитела Anti-TGF beta 1 antibody TB21 (ab190503, Abcam) с системой визуализации Ventana ultraView Universal DAB Detection Kit, с разведением коммерческого раствора антитела 1:200, инкубацией в течение 2 ч при комнатной температуре и pH 6. Протокол ИГХ-окрашивания разработали предварительно путем подбора параметров, используя в качестве контрольного материала образцы инвазивной протоковой карциномы молочной железы.

Для выявления триптазы тучных клеток использовали предназначенные для научных целей моноклональные антитела Mast Cell Tryptase (10D11, BOND) с системой визуализации Novolink Polymer Detection System (Leica), согласно протоколу производителя.

Традиционное гистохимическое окрашивание тучных клеток толуидиновым синим не применяли, так как оно в предыдущих экспериментах обеспечивало более низкое качество визуализации, чем ИГХ-метод.

С парафиновых блоков от каждого объекта изготовили по 3 среза (всего 261), окрасили гематоксилином и эозином, ИГХ-методом с антителами к TGF-β1 и триптазе тучных клеток.

При исследовании полученных гистологических микропрепаратов кожи из области прижизненных повреждений во всех 29 случаях были обнаружены отек дермы и подкожной клетчатки, очаговый спазм мелких артерий, полнокровие, дистония и паретическое расширение мелких вен, дополнительно в 16 случаях — очаговые кровоизлияния без перифокальной клеточной реакции в подкожной клетчатке и дерме, что свидетельствовало о небольшой давности причинения повреждений.

В некоторых микропрепаратах из области посмертных повреждений были выявлены признаки спазма отдельных мелких артерий, полнокровие и дистония мелких вен; в 4 случаях отмечено наличие слабовыраженных рыхлых мелкоочаговых кровоизлияний в дерме без перифокальной реакции.

Разработали и использовали полуколичественную шкалу оценки экспрессии TGF-β1 в эпидермисе, где 0 — экспрессия отсутствует, 1 — слабая мелкоочаговая, 2 — умеренно выраженная очаговая и мелкоочаговая, 3 — выраженная очагово-диффузная; 4 — экспрессия в подлежащей дерме (при условии, что экспрессия в кератиноцитах не равна 0).

Во всех экспериментальных образцах прижизненных повреждений (1-я группа) была выявлена цитоплазматическая экспрессия TGF-β1 в кератиноцитах (2—3 балла), имевшая распространенность от крупноочаговой до диффузной; дополнительно в 8 образцах выявлена отчетливая дермальная экспрессия (рис. 1 на цв. вклейке), что свидетельствовало о выходе TGF-β1 в дерму (внутренний негативный контроль — не окрашивавшиеся структуры придатков кожи). В контрольных образцах кожи как без повреждений (2-я группа), так и с посмертными повреждениями (3-я группа) экспрессия TGF-β1 в кератиноцитах или не отмечалась, или была очень слабой и локализовалась лишь в некоторых клетках базального слоя (0—1 балл). Дермальная экспрессия в образцах 2-й и 3-й групп не наблюдалась ни в одном случае. Во всех случаях экспрессия TGF-β1 в образцах 1-й группы была более выраженной, чем в соответствующих образцах обеих контрольных групп.

Рис. 1. Дермальная экспрессия TGF-β1 при ИГХ-окрашивании, ув. 200.

В целях установления достоверности полученных результатов провели статистическую обработку данных об экспрессии TGF-β1 в программе BioStat; вследствие того, что выборки являлись малыми и не имели нормального распределения значений, определяли U-критерий Манна—Уитни. Значение U-критерия составило 14 для 1-й и 2-й групп, 78 для 1-й и 3-й групп, что соответствует статистически значимым различиям признака в разных выборках (p<0,05). Таким образом, экспрессия TGF-β1 в образцах кожи 1-й группы достоверно отличалась от экспрессии в образцах 2-й и 3-й групп.

Оценку плотности дермальных тучных клеток, маркированных ИГХ-окраской с антителами к триптазе (рис. 2 на цв. вклейке), осуществляли путем подсчета в полях зрения среднего увеличения (200×) микроскопа, расположенных в дерме на всем протяжении препарата вдоль дермо-эпидермальной границы. При окуляре 10× с линейным полем зрения 22 мм и объективе 20× площадь 1 поля зрения составила ~0,95 мм².

Рис. 2. Дермальные тучные клетки, маркированные ИГХ-окрашиванием с антителами к триптазе, ув. 200.

Было выявлено значительное колебание исходной плотности интрадермальных тучных клеток в препаратах 2-й группы у разных субъектов (индивидуальные различия), значения плотности составили от 3 до 11 клеток/мм². В материале с прижизненными и посмертно причиненными повреждениями плотность тучных клеток у каждого субъекта колебалась относительно контрольного значения в сторону как увеличения, так и уменьшения и составила от 2 до 18 клеток/мм², не продемонстрировав на данном этапе каких-либо статистически значимых закономерностей.

Тучные клетки оказывают многообразное влияние на гомеостаз, тканевый иммунитет, ремоделирование и воспалительно-репаративные процессы в тканях, а также участвуют в патогенезе разных заболеваний, в том числе новообразований [4].

В судебно-медицинском аспекте реакции тучных клеток были исследованы A. Bonelli и соавт. [5], которые морфометрическим методом установили достоверные различия в плотности расположения тучных клеток в прижизненно поврежденных тканях по сравнению как с неповрежденной кожей, так и с посмертно поврежденной. Дегрануляцию тучных клеток изучали M. Oehmichen и соавт. [6, 7], отметив, что она возникает в перифокальной зоне кровоизлияний в течение нескольких минут после повреждения. По мнению G. Gauchotte и соавт. [8], методика определения дегрануляции тучных клеток достаточно чувствительна и специфична для использования в диагностике прижизненности повреждений.

В целом в вопросе о возможности исследования реакций тучных клеток в целях диагностики прижизненности повреждений имеются существенные противоречия, поскольку одни авторы считают надежным признаком изменение плотности расположения тучных клеток и ненадежным — дегрануляцию, а другие — придерживаются противоположного мнения.

Наши собственные более ранние исследования привели к выводу о ненадежности и недостоверности дегрануляции тучных клеток в качестве признака прижизненности повреждений.

Порядок полученных в настоящем исследовании значений плотности тучных клеток коррелирует с данными A. Bonelli и соавт. [5], в то же время не позволяя на этом этапе установить какие-либо статистически значимые закономерности, подобные описанным ими. Тучные клетки дермы распределены по отделам тела неравномерно [9], сгруппированы вокруг кровеносных сосудов и придатковых структур дермы, что требует тщательного отбора контрольных образцов кожи из близко расположенных или строго симметричных областей во избежание возможных ошибочных оценок. Таким образом, на данном этапе следует воздержаться от каких-либо выводов о возможности применения метода оценки плотности дермальных тучных клеток для диагностики прижизненности повреждений, планируются редизайн и продолжение исследований.

Полученные в результате серийных исследований экспериментальные данные об экспрессии TGF-β1 в эпидермисе и дерме позволяют считать с учетом результатов статистической обработки, что данный метод является достаточно достоверным, поскольку выраженность экспрессии в области прижизненных повреждений во всех исследованных случаях была значимо выше по сравнению с контрольными образцами; необходимо продолжать исследования в этом направлении.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.