Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) — проблема номер один всего населения земного шара. ВИЧ поражает самые разные слои населения, унося жизни огромного количества людей и нанося масштабный экономический урон. Для лечения больных ВИЧ-инфекцией используют сложную комбинацию различных классов антиретровирусных лекарственных средств, а при развитии оппортунистических заболеваний назначают лекарственные средства других фармакологических групп. Лечение направлено на блокирование вируса в организме больного и исключение дальнейшего его возможного размножения. Это снижает риск развития оппортунистических заболеваний, а также улучшает качество жизни больного и препятствует возможному заражению контактирующих с носителем ВИЧ здоровых людей [1]. Очень часто при ВИЧ-инфекции в схемы лечения включают абакавир. Абакавир — антиретровирусное средство, относящееся к классу нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы. Метаболизм его протекает в печени, где абакавир подвергается действию алкогольдегидрогеназы с образованием 5’-карбоновой кислоты и дальнейшей ее конъюгации с глюкуроновой кислотой, в ходе которой образуется 5’-глюкуронид. После приема внутрь абакавир достаточно быстро абсорбируется из желудочно-кишечного тракта. При приеме внутрь биодоступность абакавира составляет 83%. Через 1,5 ч после приема таблеток и через 1 ч после приема раствора концентрация абакавира в плазме крови достигает максимума. Основная часть дозы абакавира (около 83%) выводится почками в виде метаболитов и в неизмененном виде, а оставшееся количество — через кишечник [2, 3].
Встречаются случаи отравления абакавиром, но вопрос химико-токсикологического анализа абакавира остается неизученным.
Цель работы — оптимизировать методику изолирования абакавира, а также его обнаружения и количественного определения в биологических объектах.
Материал и методы
При проведении экспериментальных исследований использовали следующее оборудование: спектрофотометр СФ-2000 (РФ), хроматограф «Милихром А-02» с УФ-детектором, оборудование для твердофазной экстракции: система Waters и патроны марки Oasis HLB.
Также использовали таблетки абакавира по 0,3 г (АО «Фармасинтез», Россия), воду очищенную, органические ХИМИЧЕСКИ ЧИСТЫЕ (х.ч.) растворители (трихлорметан, дихлорметан, эфир, этилацетат, бензол, изопропанол, гексан ), химические чистые растворы электролитов (20% раствор NaCl, насыщенный раствор NaCl, 5% раствор Na2SO4, насыщенный раствор Na2SO4, 20% раствор (NH4)2SO4 и насыщенный раствор (NH4)2SO4).
Жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ). Навеску 0,05 г препарата растворяли в 1 мл воды, доводили pH от 2,0 до 11,0 с помощью 0,1 M раствора хлористоводородной кислоты и 25% раствора аммиака и затем экстрагировали органическим растворителем. Оставляли при комнатной температуре до полного испарения органического растворителя [4].
Твердофазная экстракция (ТФЭ). Кондиционирование сорбента заключалось в последовательном промывании его 3 мл метанола «х.ч.» и 3 мл фосфатного буфера pH 6,0. Образец загружали в патрон и последовательно промывали водой, подкисленной водой и гексаном «х.ч.». Далее патрон просушивали под вакуумом в течение 20 мин и элюировали. Элюент 1 — гексан:этилацетат (1:1); элюент 2 — дихлорметан:изопропиловый спирт:25% раствор аммиака (72:20:2). Полученные элюаты оставляли при комнатной температуре до полного испарения органических растворителей.
Для идентификации абакавира в качестве предварительного метода использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ) в тонком слое сорбента, а в качестве подтверждающих методов и для оценки количественного содержания абакавира в извлечениях применяли УФ-спектрофотометрию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) [5—7].
Идентификацию абакавира в извлечениях методом ТСХ проводили по следующей методике: на линию старта хроматографической пластинки «Сорбфил» наносили по 0,4 мл извлечений абакавира. Пластинку высушивали и хроматографировали в системе этилацетат:трихлорметан:25% раствор аммиака (17:4:1) восходящим методом. После прохождения фронта растворителя пластинку вынимали из камеры, сушили при комнатной температуре в течение 20 мин, детектировали пятна в УФ-лучах при λ=254 нм.
Обнаружение абакавира в извлечениях методом УФ-спектрофотометрии проводили по следующей методике: к сухому остатку добавляли 10 мл воды, отбирали 1 мл раствора, помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили 0,1M раствором хлористоводородной кислоты до метки. Спектр поглощения раствора абакавира регистрировали на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм в области λ=220—400 нм.
Обнаружение и количественное определение абакавира в извлечениях методом ВЭЖХ проводили по следующей методике [8, 9]: использовали колонку с обращенно-фазовым сорбентом ProntoSIL-120-5 C18 AQ. Подвижная фаза: элюент 1 — 4 M раствор лития перхлората:0,1 M раствор хлористоводородной кислоты (5:95); элюент 2 — ацетонитрил. Условия проведения анализа: линейный градиент растворителя 2000 мкл от 5 до 100%, скорость потока 150 мкл/мин, температура колонки 35 °C, объем пробы 2 мкл, λ=280 нм. Количественное содержание абакавира в извлечениях рассчитывали по стандартному образцу.
Статистическую обработку результатов анализа проводили по методике, изложенной в ГФ XIV ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов эксперимента».
Результаты и обсуждение
Для разработки оптимальной методики изолирования абакавира из биологических объектов методом ЖЖЭ первоначально экспериментально подбирали органический растворитель, значение pH среды, электролит, оказывающий высаливающее действие, время и кратность экстракции.
Дихлорметан, трихлорметан, этилацетат, эфир и бензол не растворяют абакавир и не смешиваются с водой, поэтому были предложены для изучения процесса экстракции абакавира. Абакавир — соль замещенного аммония, которая хорошо растворима в воде. В связи с этим для приготовления исходных растворов абакавира в качестве растворителя выбрали воду очищенную.
Значение pH среды оказывает большое влияние на изолирование исследуемого вещества. При изменении значений pH среды меняется соотношение молекул и ионов исследуемого вещества. Известно, что в органический растворитель вещества изолируются в молекулярном виде. На рис. 1 представлена графическая зависимость степени экстракции абакавира от значений pH среды и природы растворителя. Абакавир максимально изолируется из водных растворов трихлорметаном при pH 8,0.
Рис. 1. Степень экстракции абакавира в различных растворителях и при различных значениях pH.
Электролит может оказывать как всаливающее, так и высаливающее действие. Высаливающее действие электролита увеличивает переход вещества в органический растворитель. Изучение влияния электролитов на степень экстракции абакавира показало, что насыщенные растворы электролитов NaCl «х.ч.» и (NH4)2SO4 «х.ч.» повышают переход абакавира в фазу трихлорметана. Они оказывают высаливающее действие. В присутствии этих электролитов экстракция увеличивается до 79,4±2,1 и 80,3±1,8% соответственно. Всаливающее действие на абакавир оказывает 20% раствор NaCl «х.ч.».
При более длительном контакте органического растворителя с водным раствором возможен более качественный переход молекул вещества в органический растворитель. В данном случае увеличение времени экстракции до 7 мин не привело к возрастанию степени экстракции абакавира.
Предположили, что введение новых порций органического растворителя может увеличить степень экстракции. Определили, что изменение кратности экстракции не приводит к увеличению выхода абакавира.
Полученные данные применили для разработки методики изолирования абакавира из биологических объектов — мочи, слюны и печени.
Методика изолирования абакавира из модельной смеси мочи: каждую навеску абакавира 0,6; 0,9 и 1,2 г растворяли в 15 мл воды (учитывали растворимость абакавира) и вносили в 35 мл свежеотобранной мочи здорового человека, оставляли при комнатной температуре на 24 ч, регулярно перемешивая. Модельную смесь фильтровали и отбрасывали первые порции фильтрата. Затем 1 мл фильтрата переносили в колбу, добавляли 25% раствор аммиака до pH 8,0, 1 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4 и 3 мл хлороформа. Содержимое колбы взбалтывали в течение 3 мин и вносили в делительную воронку. После разделения фаз сливали слой хлороформа, который затем удаляли при температуре 20 °C.
Методика изолирования абакавира из модельной смеси слюны: 20 мл слюны замораживали для инактивации присутствующих в ней ферментов. Через 24 ч слюну подвергали разморозке при комнатной температуре, смешивали с раствором абакавира в трех различных концентрациях (навеску абакавира 0,6; 0,9 и 1,2 г растворяли в 15 мл воды), оставляли каждую на 24 ч при комнатной температуре, регулярно помешивая. В модельный образец слюны добавляли 1 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты «х.ч.» для осаждения белков, перемешивали, отстаивали 10—15 мин и центрифугировали. Далее 1 мл полученного центрифугата переносили в колбу, добавляли 25% раствор аммиака до pH 8,0, 1 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4 и 3 мл хлороформа. Содержимое колбы взбалтывали в течение 3 мин и вносили в делительную воронку. После разделения фаз сливали слой хлороформа, который далее удаляли при температуре 20 °C.
Методика приготовления модельных проб из печени: к 25 г измельченной трупной печени добавляли раствор абакавира (навески препарата массой 0,3; 0,6 и 0,9 г, каждая из которых растворена в 15 мл воды), перемешивали. Приготовленные образцы оставляли на сутки при комнатной температуре, регулярно перемешивая.
Изолирование абакавира из модельных образцов трупной печени проводили по методам Васильевой, Крамаренко и Стаса—Отто [10]. Дальнейшую экстракцию абакавира из центрифугатов осуществляли хлороформом при pH 8,0 в присутствии электролита насыщенного раствора (NH4)2SO4 однократно в течение 3 мин [11].
Идентификацию абакавира на предварительном этапе исследования проводили методом ТСХ с использованием системы этилацетат:трихлорметан:25% раствор аммиака (17:4:1) восходящим методом. Значение Rf пятна извлечения абакавира из биологического материала соответствовало значению Rf стандартного образца свидетеля абакавира (0,15±0,01).
УФ-спектр стандартного образца абакавира характеризуется максимумом поглощения при λ=297±1 нм, что соответствует максимуму поглощения абакавира в извлечениях, полученных из биологических объектов [12].
При обнаружении абакавира методом ВЭЖХ на хроматограмме стандартного образца наблюдали один пик с временем удерживания 9,5 мин (рис. 2), что совпадало со временем удерживания абакавира, полученного после извлечения из биологических объектов.
Рис. 2. Хроматограмма раствора стандартного образца абакавира.
Количественную оценку степени экстракции абакавира из мочи, слюны и печени проводили методом ВЭЖХ.
Статистически обработанные результаты представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1. Степень извлечения абакавира из мочи и слюны
| Биологический объект | Метрологические характеристики, n=6, P=0,95% | ||
| 0,6 г | 0,9 г | 1,2 г | |
| Моча | х̅=76,42%; Sх̅=1,15; ΔХ=2,96; ε=3,87%; CV=3,41% | х̅=82,23%; Sх̅=1,57; ΔХ=4,03; ε=4,91%; CV=3,16% | х̅=64,32%; Sх̅=2,52; ΔХ=6,48; ε=10,07%; CV=3,55% |
| Слюна | х̅=65,38%; Sх̅=2,13; ΔХ=5,47; E̅%=8,37%; CV=3,98% | х̅=68,4%; Sх̅=2,61; ΔХ=6,71; E̅%=9,81%; CV=4,15% | х̅=68,1%; Sх̅=2,44; ΔХ=6,27; E̅%=9,21%; CV=3,33% |
Таблица 2. Степень извлечения абакавира из печени
| Метод | Метрологические характеристики, n=6, P=0,95% | ||
| 0,6 г | 0,9 г | 1,2 г | |
| Васильевой | х̅=65,1%; Sх̅=1,69; ΔХ=4,34; E̅%=6,67%; CV=3,29% | х̅=65,3%; Sх̅=1,79; ΔХ=4,60; E̅%=7,04%; CV=3,38% | х̅=67,4%; Sх̅=1,94; ΔХ=4,99; E̅%=7,40%; CV=3,64% |
| Крамаренко | х̅=70,3%; Sх̅=1,59; ΔХ=4,09; E̅%=5,81%; CV=4,13% | х̅=74,5%; Sх̅=1,65; ΔХ=4,24; E̅%=5,69%; CV=3,69% | х̅=74,6%; Sх̅=1,81; ΔХ=4,65; E̅%=6,24%; CV=3,67% |
| Стаса—Отто | х̅=70,6%; Sх̅=1,57; ΔХ=4,03; E̅%=5,72%; CV=3,72% | х̅=74,8%; Sх̅=1,77; ΔХ=4,55; E̅%=6,08%; CV=3,68% | х̅=74,7%; Sх̅=1,49; ΔХ=3,83; E̅%=5,13%; CV=3,91% |
Из данных табл. 1 и 2 видно, что с помощью разработанной методики из мочи, слюны и печени изолируется достаточное количество абакавира для установления факта отравления.
Степень экстракции из модельных образцов мочи, слюны и печени методом твердофазной экстракции составила 79,9±2,2; 81,8±2,4 и 80,7±1,9% соответственно.
Полученные результаты валидационной оценки методики, проведенной в соответствии с методическими рекомендациями [13], подтверждают ее пригодность. Таким образом, разработанная методика может быть рекомендована для химико-токсикологического и судебно-химического анализов абакавира. На основании полученных данных можно сделать вывод, что для изолирования абакавира из мочи, слюны и печени можно использовать как метод ЖЖЭ, так и ТФЭ.
Выводы
1. Подобраны условия изолирования абакавира (экстрагент, pH среды, электролит, время и кратность экстракции) с помощью ЖЖЭ хлороформом при pH 8,0 в присутствии электролита насыщенного раствора (NH4)2SO4 однократно в течение 3 мин.
2. Оптимизированы методики изолирования абакавира из биологических объектов: мочи, слюны и печени — с помощью ЖЖЭ и ТФЭ. Валидационная оценка свидетельствует о пригодности предложенных методик для изолирования абакавира из мочи, слюны и печени. Относительное стандартное отклонение (RSD) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышала 5,4% (ЖЖЭ) и 2,3% (ТФЭ) для мочи; 4,2% (ЖЖЭ) и 3,1% (ТФЭ) для слюны; 4,87% (ЖЖЭ) и 2,5% (ТФЭ) для печени.
3. Оптимизированы методики идентификации и количественного определения абакавира в извлечениях из мочи, слюны и печени методами тонкослойной хроматографии в системе этилацетат:трихлорметан:25% раствор аммиака (17:4:1), УФ-спектрофотометрии с максимумом поглощения при λ=297±1 нм и ВЭЖХ (пик с временем удерживания 9,5 мин).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.