Судебно-медицинское значение взаимосвязи активности протеолитических ферментов и динамики интенсивности флуоресценции коферментов NADH и FAD в скелетной мышце при диагностике давности наступления смерти (экспериментальное исследование)

Главным пусковым фактором изменений тканевого и клеточного метаболизма в посмертном периоде является дефицит кислорода. Это отражается на биохимических, биофизических свойствах тканей, изучение которых имеет большое значение для решения важнейшего судебно-медицинского вопроса о давности наступления смерти (ДНС). Основные биохимические процессы, обусловливающие энергетический метаболизм в раннем посмертном периоде, — креатинкиназная реакция и анаэробный гликолиз характерны для тканей при ишемии любой этиологии [1]. Исследования молекулярных механизмов умирания ткани в суправитальном периоде, а также в предшествующем ему периоде переживаемости, который определяется как время глобальной ишемии, в течение которого сохраняются жизнеспособность ткани и возможность функционального восстановления, вносят неоценимый вклад в развитие клинической и фундаментальной медицины [2]. Основоположник реаниматологии В.А. Неговский неоднократно подчеркивал необходимость тщательного изучения танатологии: «Чем глубже будет происходить это изучение [смерти], тем больше будет сниматься мистический налет со слова «смерть», тем более понятными и объяснимыми станут все элементы этого сложного, но неизбежного явления жизни» [3].

В результате проведенных нами ранее [4, 5] экспериментальных исследований выявлена зависимость интенсивности флуоресценции коферментов NADH и FAD в скелетной мышце от времени, прошедшего после смерти. Эта зависимость характеризуется возрастанием флуоресценции NADH в течение 3 ч посмертного периода и постепенным ее снижением спустя 4,5 ч к концу 1-х суток, преобладанием флуоресценции NADH над FAD до 9 ч посмертного периода, а также значимым возрастанием флуоресценции FAD к концу 1-х суток.

Увеличение интенсивности флуоресценции NADH в условиях аноксии обусловлено накоплением в цитоплазме его восстановленной формы вследствие анаэробного гликолиза, которая обладает аутофлуоресцентными свойствами в отличие от формы окисленной. Существует гипотеза о влиянии митохондриального отека, развивающегося при ишемии, на интенсивность флуоресценции NADH в связи с увеличением поперечного сечения рассеяния флуоресцентного сигнала [6].

Механизмы снижения интенсивности флуоресценции NADH через 4,5 ч после смерти и увеличения флуоресценции FAD к концу 1-х суток посмертного периода неизвестны. По данным биологических и биофизических исследований, интенсивность флуоресценции коферментов зависит от таких факторов, как pH клетки, вязкость цитоплазмы, концентрация коферментов и их внутриклеточная локализация (митохондрии или цитозоль), связь с белками [7].

A. Donaldson и I. Lamont [8] выявили линейное возрастание концентрации NADH в течение 96 ч в крови умерших, а также в крови, находящейся весь этот период в условиях in vitro, в вакуумных пробирках. В течение 96 ч концентрация NADH в трупной крови возрастала от 1—2,5 до 15—28,5 ммоль/л, концентрация NADH в крови in vitro увеличивалась с 0,1—0,6 до 2,0—2,3 ммоль/л. Исследование показало, что образование NADH в результате анаэробного гликолиза продолжается как минимум 96 ч [8].

Согласно собственным данным, интенсивность флуоресценции NADH снижается уже через 4,5 ч после смерти, а уменьшение флуоресценции NADH в ткани связано не с сокращением образования кофермента, а с изменением его флуоресцентных свойств.

Внутриклеточный NADH существует как в свободных, так и в связанных формах в сопоставимых концентрациях (свободный/связанный равен 0,78). Исследование A. Heikal [7] и H. Vishwasrao [9] показали, что 93% интенсивности флуоресценции обеспечивает связанная с белком форма NADH.

Нами сформулировано предположение, что характер динамики интенсивности флуоресценции NADH и FAD обусловлен диссоциацией связанных форм коферментов вследствие протеолитического воздействия внутриклеточных ферментов, активизирующихся в раннем посмертном периоде.

Цель работы — оценить взаимосвязь активности протеолитических ферментов, катепсина D и кальпаинов и динамики интенсивности флуоресценции коферментов NADH и FAD в скелетной мышце крысы в раннем посмертном периоде в зависимости от ДНС.

Эксперимент проводили на 20 крысах-самцах линии Sprague Dawley массой 250—300 г в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Перед исследованием животные находились в одинаковых условиях. Эвтаназию осуществляли цервикальной дислокацией под общей анестезией хлоралгидратом. Трупы животных сохраняли при комнатной температуре. Измерение интенсивности флуоресценции коферментов FAD и NADH и забор скелетной мышцы для исследования активности ферментов осуществляли во временных точках посмертного периода, соответствующих наиболее значимым изменениям выявленной ранее динамики флуоресценции коферментов: 1) через 5 мин после смерти (n=5); 2) через 3 ч (n=5); 3) 4,5 ч (n=5); 4) 24 ч (n=5).

Для проведения лазериндуцированной флуоресцентной спектроскопии использовали диагностический аппарат «Лазма МЦ-3» (ООО НПП «Лазма», Россия) с зондирующем излучением длиной волны 365 нм (UV) и 450 нм (B) с программным обеспечением. Доступ к мышце бедра крысы обеспечивали через разрез кожи длиной 1 см, устанавливали волоконно-оптический зонд анализатора коферментов на участок поверхности скелетной мышцы. Измерение показателей у каждого животного проводили в течение 4 мин. Автоматически рассчитанные значения флуоресценции NADH и FAD сохраняли в персональном компьютере.

Затем производили забор скелетных мышц для исследования протеолитической активности ферментов — катепсина D и кальпаинов. Бедренную мышцу тщательно измельчали ножницами и гомогенизировали в 0,9% растворе NaCl. Полученный гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин. Супернатант переносили в чистую пробирку. Для определения протеолитической активности ферментов использовали метод Ансона в модификации Е. Каверзневой. Протеолитическую активность ферментов выражали в мкмоль/ч на 1 г ткани.

Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ Statistica 13. Нормальность распределения данных проверяли с помощью тест Лиллиефорса. Рассчитывали среднее значение показателей с указанием стандартного отклонения. Для признаков с отличным от нормального распределения указывали медиану с межквартильным размахом — 25-й и 75-й процентили. Величины показателей сравнивали непараметрическим методом (U-test Манна-Уитни). Различия принимали статистически значимыми при p<0,05.

Динамика интенсивности флуоресценции коферментов NADH и FAD в настоящем исследовании имеет тот же характер, что и в предыдущих исследованиях. Отметили возрастание флуоресценции NADH через 3 ч после смерти, а по прошествии 4,5 ч — снижение флуоресценции этого кофермента. Повышение интенсивности флуоресценции FAD зарегистрировали через 24 ч после смерти (рис. 1).

Рис. 1. Интенсивность флуоресценции NADH и FAD в скелетной мышце крыс в различные сроки после смерти.

Значения показателей представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего (M±SEM).

В течение первых 3 ч посмертного периода, которые соответствуют увеличению интенсивности флуоресценции NADH, протеолитическая активность катепсина D и кальпаинов оставалась низкой.

Через 4,5 ч наблюдали повышение протеолитической активности катепсина D и кальпаинов. Увеличение протеолитической активности катепсина D через 4,5 ч после смерти оказалось статистически значимо по сравнению с активностью через 3 ч (p=0,01) и на 5-й минуте (p=0,02) посмертного периода.

Спустя 24 ч после смерти активность катепсина D незначительно увеличивается, а активность кальпаинов статистически значимо снижается по сравнению с активностью через 3 ч (p=0,04) и 5 мин (p=0,03) (рис. 2).

Рис. 2. Активность протеолитических ферментов катепсина D (а) и кальпаинов (б) в скелетной мышце крыс в различные сроки после смерти.

Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Me [25%;75%]).

* — p<0,05 при сравнении со значением показателя через 3 ч после смерти; ^ — p<0,05 при сравнении со значением показателя через 5 мин после смерти.

Результаты исследования позволяют предположить, что характер посмертной динамики интенсивности флуоресценции коферментов во многом обусловлен особенностями внутриклеточного протеолиза.

Анализ изображений с высоким пространственным разрешением, полученных в результате микроскопии с визуализацией времени жизни флуоресценции NADH и FAD (TCSPC-FLIM), показал, что 61% внутриклеточного NADH локализован в митохондриях, где он принимает участие в окислительном фосфорилировании и цикле трикарбоновых кислот, 19% — в цитоплазме (гликолиз), 17% — в ядре (пути транскрипции). FAD расположен в основном в митохондриях [7].

Кальпаины — Ca²⁺-зависимые нелизосомальные цистеиновые протеиназы локализованы, как правило, в цитозоле, а также в митохондриях. Известна роль кальпаинов в апоптозе, клеточном цикле, дифференцировании, некрозе [10]. В физиологических условиях неактивные кальпаины накапливаются в цитозоле в связанном состоянии с их эндогенным ингибитором — кальпастатином. Повышение содержания внутриклеточного кальция является ключом к активации кальпаинов. Среди субстратов кальпаинов — белки цитоскелета и митохондрии [11]. Кальпаин участвует в открытии митохондриальных пор высокой проницаемости [12]. Посмертное перераспределение Ca²⁺, индуцируемое аноксией, приводит к перегрузке клеток кальцием. Накопление кальция в митохондриях вызывает переходную деполяризацию митохондриального мембранного потенциала, что снижает выработку АТФ [7]. Согласно исследованию В.В. Жарова [13], через 4 ч после смерти в скелетной мышце экспериментальных животных снижается концентрация АТФ. Следовательно, можно предположить, что через 4 ч происходит накопление кальция в митохондриях. По нашим данным, примерно в этот же период посмертного интервала (4,5 ч) возрастает активность кальпаинов. Снижение активности кальпаинов через 24 ч, возможно, связано с истощением субстрата кальпаинов и полным разрушением митохондрий.

Катепсин D — лизосомальная кислая протеиназа, имеющая большое значение во внутриклеточной деградации белков. При ишемии сначала увеличивается проницаемость лизосомальной мембраны, а впоследствии происходит разрыв лизосом. Частичное повышение проницаемости лизосомальной мембраны вызывает апоптоз — запрограммированную гибель клеток, полный разрыв лизосомы приводит к некрозу [14, 15]. Катепсин D обеспечивает самое быстрое переваривание смеси цитозольных белков при pH 5,0 [16]. Использование ингибиторов протеиназ показало, что при низком значении pH основным ферментом, участвующим в переваривании митохондрий, был катепсин D [17].

A. Mellors и соавт. (1967) на изолированных митохондриях показали, что лизосомальные ферменты могут вызвать их набухание и разобщение окислительного фосфорилирования [18]. Исследования сердечной мышцы в условиях гипоксии продемонстрировали структурные и функциональные изменения митохондрий, возникающие в результате высвобождения катепсина D и других лизосомальных ферментов в цитоплазму во время аноксии и ишемии [19]. По результатам анализа собственных данных и исследований других авторов можно предположить, что снижение интенсивности флуоресценции NADH через 4,5 ч после смерти обусловлено диссоциацией связанной с белком формы NADH, локализующейся в цитозоле, так как эта форма более доступна для протеолитических ферментов на первых этапах аутолиза. Дальнейшие повреждение и повышение проницаемости мембран митохондрий вызывают диссоциацию внутримитохондриального NADH. Полное разрушение митохондрий через 24 ч способствует высвобождению FAD, свободная форма которого флуоресцирует интенсивнее, что подтверждается разной направленностью кривых динамики интенсивности флуоресценции коферментов и отражается на их отношении.

Результаты исследования показали, что в период увеличения интенсивности флуоресценции NADH, в течение 3 ч после смерти, активность протеолитических ферментов катепсина D и кальпаинов низкая. Протеолитическая активность ферментов возрастает через 4,5 ч после смерти, что соответствует начальной точке снижения интенсивности флуоресценции NADH. Через 24 ч после смерти, что соответствует увеличению интенсивности флуоресценции FAD, наблюдается значимое снижение активности кальпаинов. Связь флуоресцентных свойств ткани с молекулярными механизмами умирания клеток доказывает перспективность и обоснованность применения метода лазериндуцированной спектроскопии для оценки посмертных изменений при установлении ДНС.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.