Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Бабкина А.С.

Медицинский институт Российского университета дружбы народов;
Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В.А. Неговского Федерального научно-клинического центра реаниматологии и реабилитологии

Сундуков Д.В.

Медицинский институт Российского университета дружбы народов

Голубев А.М.

Медицинский институт Российского университета дружбы народов;
Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В.А. Неговского Федерального научно-клинического центра реаниматологии и реабилитологии

Судебно-медицинское значение взаимосвязи активности протеолитических ферментов и динамики интенсивности флуоресценции коферментов NADH и FAD в скелетной мышце при диагностике давности наступления смерти (экспериментальное исследование)

Авторы:

Бабкина А.С., Сундуков Д.В., Голубев А.М.

Подробнее об авторах

Просмотров: 1231

Загрузок: 35


Как цитировать:

Бабкина А.С., Сундуков Д.В., Голубев А.М. Судебно-медицинское значение взаимосвязи активности протеолитических ферментов и динамики интенсивности флуоресценции коферментов NADH и FAD в скелетной мышце при диагностике давности наступления смерти (экспериментальное исследование). Судебно-медицинская экспертиза. 2021;64(3):24‑28.
Babkina AS, Sundukov DV, Golubev AM. The forensic implications of the relationship between the proteolytic enzymes activity and the changes in NADH and FAD fluorescence intensity in skeletal muscle when determining the time of death (experimental study). Forensic Medical Expertise. 2021;64(3):24‑28. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/sudmed20216403124

Рекомендуем статьи по данной теме:
Тер­мо­мет­ри­чес­кое оп­ре­де­ле­ние дав­нос­ти нас­туп­ле­ния смер­ти ме­то­дом не­ли­ней­ной оп­ти­ми­за­ции. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(5):19-23
Ха­рак­те­рис­ти­ка пос­мер­тных из­ме­не­ний го­лов­но­го моз­га. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(6):56-61
Ас­со­ци­ации сы­во­ро­точ­ных ней­ро­мар­ке­ров с кли­ни­чес­ки­ми осо­бен­нос­тя­ми бо­лез­ни Пар­кин­со­на. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. 2024;(4):145-152

Главным пусковым фактором изменений тканевого и клеточного метаболизма в посмертном периоде является дефицит кислорода. Это отражается на биохимических, биофизических свойствах тканей, изучение которых имеет большое значение для решения важнейшего судебно-медицинского вопроса о давности наступления смерти (ДНС). Основные биохимические процессы, обусловливающие энергетический метаболизм в раннем посмертном периоде, — креатинкиназная реакция и анаэробный гликолиз характерны для тканей при ишемии любой этиологии [1]. Исследования молекулярных механизмов умирания ткани в суправитальном периоде, а также в предшествующем ему периоде переживаемости, который определяется как время глобальной ишемии, в течение которого сохраняются жизнеспособность ткани и возможность функционального восстановления, вносят неоценимый вклад в развитие клинической и фундаментальной медицины [2]. Основоположник реаниматологии В.А. Неговский неоднократно подчеркивал необходимость тщательного изучения танатологии: «Чем глубже будет происходить это изучение [смерти], тем больше будет сниматься мистический налет со слова «смерть», тем более понятными и объяснимыми станут все элементы этого сложного, но неизбежного явления жизни» [3].

В результате проведенных нами ранее [4, 5] экспериментальных исследований выявлена зависимость интенсивности флуоресценции коферментов NADH и FAD в скелетной мышце от времени, прошедшего после смерти. Эта зависимость характеризуется возрастанием флуоресценции NADH в течение 3 ч посмертного периода и постепенным ее снижением спустя 4,5 ч к концу 1-х суток, преобладанием флуоресценции NADH над FAD до 9 ч посмертного периода, а также значимым возрастанием флуоресценции FAD к концу 1-х суток.

Увеличение интенсивности флуоресценции NADH в условиях аноксии обусловлено накоплением в цитоплазме его восстановленной формы вследствие анаэробного гликолиза, которая обладает аутофлуоресцентными свойствами в отличие от формы окисленной. Существует гипотеза о влиянии митохондриального отека, развивающегося при ишемии, на интенсивность флуоресценции NADH в связи с увеличением поперечного сечения рассеяния флуоресцентного сигнала [6].

Механизмы снижения интенсивности флуоресценции NADH через 4,5 ч после смерти и увеличения флуоресценции FAD к концу 1-х суток посмертного периода неизвестны. По данным биологических и биофизических исследований, интенсивность флуоресценции коферментов зависит от таких факторов, как pH клетки, вязкость цитоплазмы, концентрация коферментов и их внутриклеточная локализация (митохондрии или цитозоль), связь с белками [7].

A. Donaldson и I. Lamont [8] выявили линейное возрастание концентрации NADH в течение 96 ч в крови умерших, а также в крови, находящейся весь этот период в условиях in vitro, в вакуумных пробирках. В течение 96 ч концентрация NADH в трупной крови возрастала от 1—2,5 до 15—28,5 ммоль/л, концентрация NADH в крови in vitro увеличивалась с 0,1—0,6 до 2,0—2,3 ммоль/л. Исследование показало, что образование NADH в результате анаэробного гликолиза продолжается как минимум 96 ч [8].

Согласно собственным данным, интенсивность флуоресценции NADH снижается уже через 4,5 ч после смерти, а уменьшение флуоресценции NADH в ткани связано не с сокращением образования кофермента, а с изменением его флуоресцентных свойств.

Внутриклеточный NADH существует как в свободных, так и в связанных формах в сопоставимых концентрациях (свободный/связанный равен 0,78). Исследование A. Heikal [7] и H. Vishwasrao [9] показали, что 93% интенсивности флуоресценции обеспечивает связанная с белком форма NADH.

Нами сформулировано предположение, что характер динамики интенсивности флуоресценции NADH и FAD обусловлен диссоциацией связанных форм коферментов вследствие протеолитического воздействия внутриклеточных ферментов, активизирующихся в раннем посмертном периоде.

Цель работы — оценить взаимосвязь активности протеолитических ферментов, катепсина D и кальпаинов и динамики интенсивности флуоресценции коферментов NADH и FAD в скелетной мышце крысы в раннем посмертном периоде в зависимости от ДНС.

Материал и методы

Эксперимент проводили на 20 крысах-самцах линии Sprague Dawley массой 250—300 г в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Перед исследованием животные находились в одинаковых условиях. Эвтаназию осуществляли цервикальной дислокацией под общей анестезией хлоралгидратом. Трупы животных сохраняли при комнатной температуре. Измерение интенсивности флуоресценции коферментов FAD и NADH и забор скелетной мышцы для исследования активности ферментов осуществляли во временных точках посмертного периода, соответствующих наиболее значимым изменениям выявленной ранее динамики флуоресценции коферментов: 1) через 5 мин после смерти (n=5); 2) через 3 ч (n=5); 3) 4,5 ч (n=5); 4) 24 ч (n=5).

Для проведения лазериндуцированной флуоресцентной спектроскопии использовали диагностический аппарат «Лазма МЦ-3» (ООО НПП «Лазма», Россия) с зондирующем излучением длиной волны 365 нм (UV) и 450 нм (B) с программным обеспечением. Доступ к мышце бедра крысы обеспечивали через разрез кожи длиной 1 см, устанавливали волоконно-оптический зонд анализатора коферментов на участок поверхности скелетной мышцы. Измерение показателей у каждого животного проводили в течение 4 мин. Автоматически рассчитанные значения флуоресценции NADH и FAD сохраняли в персональном компьютере.

Затем производили забор скелетных мышц для исследования протеолитической активности ферментов — катепсина D и кальпаинов. Бедренную мышцу тщательно измельчали ножницами и гомогенизировали в 0,9% растворе NaCl. Полученный гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин. Супернатант переносили в чистую пробирку. Для определения протеолитической активности ферментов использовали метод Ансона в модификации Е. Каверзневой. Протеолитическую активность ферментов выражали в мкмоль/ч на 1 г ткани.

Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ Statistica 13. Нормальность распределения данных проверяли с помощью тест Лиллиефорса. Рассчитывали среднее значение показателей с указанием стандартного отклонения. Для признаков с отличным от нормального распределения указывали медиану с межквартильным размахом — 25-й и 75-й процентили. Величины показателей сравнивали непараметрическим методом (U-test Манна-Уитни). Различия принимали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Динамика интенсивности флуоресценции коферментов NADH и FAD в настоящем исследовании имеет тот же характер, что и в предыдущих исследованиях. Отметили возрастание флуоресценции NADH через 3 ч после смерти, а по прошествии 4,5 ч — снижение флуоресценции этого кофермента. Повышение интенсивности флуоресценции FAD зарегистрировали через 24 ч после смерти (рис. 1).

Рис. 1. Интенсивность флуоресценции NADH и FAD в скелетной мышце крыс в различные сроки после смерти.

Значения показателей представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего (M±SEM).

В течение первых 3 ч посмертного периода, которые соответствуют увеличению интенсивности флуоресценции NADH, протеолитическая активность катепсина D и кальпаинов оставалась низкой.

Через 4,5 ч наблюдали повышение протеолитической активности катепсина D и кальпаинов. Увеличение протеолитической активности катепсина D через 4,5 ч после смерти оказалось статистически значимо по сравнению с активностью через 3 ч (p=0,01) и на 5-й минуте (p=0,02) посмертного периода.

Спустя 24 ч после смерти активность катепсина D незначительно увеличивается, а активность кальпаинов статистически значимо снижается по сравнению с активностью через 3 ч (p=0,04) и 5 мин (p=0,03) (рис. 2).

Рис. 2. Активность протеолитических ферментов катепсина D (а) и кальпаинов (б) в скелетной мышце крыс в различные сроки после смерти.

Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Me [25%;75%]).

* — p<0,05 при сравнении со значением показателя через 3 ч после смерти; ^ — p<0,05 при сравнении со значением показателя через 5 мин после смерти.

Результаты исследования позволяют предположить, что характер посмертной динамики интенсивности флуоресценции коферментов во многом обусловлен особенностями внутриклеточного протеолиза.

Анализ изображений с высоким пространственным разрешением, полученных в результате микроскопии с визуализацией времени жизни флуоресценции NADH и FAD (TCSPC-FLIM), показал, что 61% внутриклеточного NADH локализован в митохондриях, где он принимает участие в окислительном фосфорилировании и цикле трикарбоновых кислот, 19% — в цитоплазме (гликолиз), 17% — в ядре (пути транскрипции). FAD расположен в основном в митохондриях [7].

Кальпаины — Ca2+-зависимые нелизосомальные цистеиновые протеиназы локализованы, как правило, в цитозоле, а также в митохондриях. Известна роль кальпаинов в апоптозе, клеточном цикле, дифференцировании, некрозе [10]. В физиологических условиях неактивные кальпаины накапливаются в цитозоле в связанном состоянии с их эндогенным ингибитором — кальпастатином. Повышение содержания внутриклеточного кальция является ключом к активации кальпаинов. Среди субстратов кальпаинов — белки цитоскелета и митохондрии [11]. Кальпаин участвует в открытии митохондриальных пор высокой проницаемости [12]. Посмертное перераспределение Ca2+, индуцируемое аноксией, приводит к перегрузке клеток кальцием. Накопление кальция в митохондриях вызывает переходную деполяризацию митохондриального мембранного потенциала, что снижает выработку АТФ [7]. Согласно исследованию В.В. Жарова [13], через 4 ч после смерти в скелетной мышце экспериментальных животных снижается концентрация АТФ. Следовательно, можно предположить, что через 4 ч происходит накопление кальция в митохондриях. По нашим данным, примерно в этот же период посмертного интервала (4,5 ч) возрастает активность кальпаинов. Снижение активности кальпаинов через 24 ч, возможно, связано с истощением субстрата кальпаинов и полным разрушением митохондрий.

Катепсин D — лизосомальная кислая протеиназа, имеющая большое значение во внутриклеточной деградации белков. При ишемии сначала увеличивается проницаемость лизосомальной мембраны, а впоследствии происходит разрыв лизосом. Частичное повышение проницаемости лизосомальной мембраны вызывает апоптоз — запрограммированную гибель клеток, полный разрыв лизосомы приводит к некрозу [14, 15]. Катепсин D обеспечивает самое быстрое переваривание смеси цитозольных белков при pH 5,0 [16]. Использование ингибиторов протеиназ показало, что при низком значении pH основным ферментом, участвующим в переваривании митохондрий, был катепсин D [17].

A. Mellors и соавт. (1967) на изолированных митохондриях показали, что лизосомальные ферменты могут вызвать их набухание и разобщение окислительного фосфорилирования [18]. Исследования сердечной мышцы в условиях гипоксии продемонстрировали структурные и функциональные изменения митохондрий, возникающие в результате высвобождения катепсина D и других лизосомальных ферментов в цитоплазму во время аноксии и ишемии [19]. По результатам анализа собственных данных и исследований других авторов можно предположить, что снижение интенсивности флуоресценции NADH через 4,5 ч после смерти обусловлено диссоциацией связанной с белком формы NADH, локализующейся в цитозоле, так как эта форма более доступна для протеолитических ферментов на первых этапах аутолиза. Дальнейшие повреждение и повышение проницаемости мембран митохондрий вызывают диссоциацию внутримитохондриального NADH. Полное разрушение митохондрий через 24 ч способствует высвобождению FAD, свободная форма которого флуоресцирует интенсивнее, что подтверждается разной направленностью кривых динамики интенсивности флуоресценции коферментов и отражается на их отношении.

Заключение

Результаты исследования показали, что в период увеличения интенсивности флуоресценции NADH, в течение 3 ч после смерти, активность протеолитических ферментов катепсина D и кальпаинов низкая. Протеолитическая активность ферментов возрастает через 4,5 ч после смерти, что соответствует начальной точке снижения интенсивности флуоресценции NADH. Через 24 ч после смерти, что соответствует увеличению интенсивности флуоресценции FAD, наблюдается значимое снижение активности кальпаинов. Связь флуоресцентных свойств ткани с молекулярными механизмами умирания клеток доказывает перспективность и обоснованность применения метода лазериндуцированной спектроскопии для оценки посмертных изменений при установлении ДНС.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.