Изучение динамики изменений мертвого тела — одна из актуальных проблем судебно-медицинской танатологии. Установление закономерностей, происходящих в посмертном периоде, напрямую связано с определением продолжительности этого периода и соответственно давности наступления смерти (ДНС). Дополнительные трудности возникают в случаях, если объект исследования находится в состоянии гнилостных изменений или скелетированных останков с минимальным количеством мягких тканей. Это обусловлено тем, что сроки посмертной трансформации тела за счет гнилостных процессов, уничтожения тканей трупа насекомыми и позвоночными падальщиками, его скелетирования и фрагментации крайне вариабельны.

Традиционно вопрос о ДНС решается в ходе производства судебно-медицинской экспертизы трупа. В позднем посмертном периоде (после 72 ч) определение ДНС для судебно-медицинского эксперта с использованием существующих методов является сложной, а иногда и объективно неразрешимой задачей. Большинство классических методов судебной медицины, применяемых в этом периоде, неточны, а дата наступления смерти экспертом определяется во многом субъективно. Выводы эксперта имеют вероятностный характер, и устанавливаемый интервал ДНС может варьировать в широких пределах.

Выделяют две группы процессов, развивающихся после наступления биологической смерти организма: собственно трупные изменения и изменение трупа в результате действия факторов окружающей среды, в том числе микроорганизмов, насекомых, позвоночных-падальщиков и т.п. Публикации, посвященные установлению срока наступления смерти с применением микробиологических разработок, единичны [1, 2]. Это побуждает к дальнейшим исследованиям с использованием данного метода.

Значение микроорганизмов в процессах разложения органического вещества сводится к последовательной смене микробных сообществ, ассоциированных с определенным участком территории, занятой конкретной популяцией живых организмов и обусловленной трофическим статусом вида. Изменение численности микроорганизмов и скорости размножения их при разложении указывает на время, прошедшее с момента наступления смерти, и зависит от комплекса абиотических и биотических факторов среды с широким диапазоном переменных, которые оказывают влияние на рост, биоразнообразие и направление развития микробной флоры трупа [3]. В результате формируется сложная иерархическая система, в которой большинство видов (до 96—99%) входит в состав природных микробных сообществ или приурочены к биотопам тела, химический состав которого в процессе гниения находится в постоянной динамике: накапливаются летучие соединения, продукты разложения белков, полисахаридов, жиров; следовые количества серы, азота и фосфатов, а также минералы и микроэлементы в виде кальция, калия, натрия, магния, железа, хлора и меди активно включаются в конструктивный и энергетический метаболизм гнилостной микрофлоры [4, 5].

Цель работы — мониторинг состояния сообщества протеолитиков во времени и пространстве для последующей разработки подходов к объективной оценке позднего постмортального периода.

Все эксперименты с трупами животных провели с соблюдением соответствующих этических норм и правовых документов (заключение Комитета по медицинской этике при Министерстве здравоохранения и социального развития Республики Карелия и Петрозаводском государственном университете №35 от 6 ноября 2015 г., заключение Независимого этического комитета при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова от 19 ноября 2020 г.).

Материал и методы

Сочетали стандартные бактериоскопические и бактериологические методы исследования с методами молекулярной биологии и генетики, позволяющими идентифицировать виды и штаммы протеолитиков на уровне специфических ДНК или РНК (16S рибосомальной РНК — рРНК).

Пробы для микробиологического анализа отбирали в стерильные емкости. Для получения статистически достоверных результатов пробы отбирали рандомно от 3 до 5 образцов с конкретного биотопа трупа животных: кишечника (нижний отдел), кожи, шерсти, костей, хрящей (копыта) и ложа трупа. Образцы обрабатывали в течение 5—6 сут с момента поступления проб в лабораторию согласно стандартным методам бактериоскопических и бактериологических исследований. Использовали среды для учета активных участников разложения азотсодержащей органики — ГМФ агар, ГМФ бульон, среды для накопления аммонифицирующих бактерий, а также среды Мишустина, Перцовской для дифференциации спорообразующих аммонификаторов. Свежевыделенные культуры бактерий рода Bacillus идентифицировали по совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных, физиологических и биохимических признаков.

Генотипирование бактерий выполняли на базе ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» лаборатории молекулярной диагностики ЦКП «Биоинженерия» (Москва). Препараты ДНК из нативного материала получали с использованием метода щелочного выделения [6] и Wizard-технологии фирмы «Promega» (США). ПЦР-фрагменты, кодирующие полноразмерные копии генов 16S рРНК, получали с использованием праймерных систем, специфичных для генов 16S рРНК эубактерий [7] и архей [8]. Нуклеотидную последовательность полученных ПЦР-фрагментов определяли методом секвенирования ДНК по Сэнгеру [9] с помощью набора реактивов BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc., USA) на генетическом анализаторе ABIPRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA) согласно инструкциям производителя. Длина последовательности составляла не менее 1200 нуклеотидов. Близкородственные последовательности генов 16S рРНК определяли с помощью онлайн-сервисов RDP/Classifier https://rdp.cme.msu.edu/classifier/hierarchy.jps) и BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Результаты и обсуждение

В результате анализа специальной литературы и пробных опытов установили, что микробиом трупа (некробиом) — это гетерогенная, специфичная в различных местах обитания система. Определили квантитативные показатели представителей некробиома, изучили влияние ряда абиотических факторов на процессы разложения мертвого вещества, описана бактериальная сукцессия в процессе деструкции трупа [10].

Для объективной оценки ДНС большое значение имеют совокупность и разнообразие микроорганизмов, участвующих в сложных процессах разложения органического вещества.

Возрастающая проблема разработки новых методов определения ДНС, особенно в позднем посмертном периоде, заставляет задуматься об использовании в практике судебно-медицинской экспертизы биоиндикаторных тест-систем. Индикаторами могут служить ферменты, являющиеся продуктом жизнедеятельности микроорганизмов в различные сроки посмертного периода. Существенные отличительные их признаки — это возможность оценить различающиеся по времени стадии разложения трупного материала посредством появления биологических объектов разного уровня организации: бактерий, низших грибов, дрожжеподобных микроорганизмов, спор микроорганизмов и продуктов их метаболизма.

В процессах гниения трупов большое значение имеют аммонификаторы. В связи с этим основное внимание в исследовании микрофлоры трупа уделили изучению протеолитически активных групп бактерий.

Разнообразие протеолитиков — примерное число видов бактерий, обитающих в тканях и ложе трупа. Чем больше видов бактерий, тем выше компенсаторный потенциал всего некробиома: при исчезновении одного или нескольких видов бактерий вследствие изменения концентрации питательного субстрата либо негативного влияния средовых факторов их функции подавляются или передаются другим группам бактерий.

Качество протеолитиков в составе некробиома — это интегрированный показатель. Его определяют на основании оценки четырех основных параметров:

1) скорость размножения в различные периоды путрификации;

2) зависимость размножения от абиотических и биотических факторов окружающей среды;

3) способность бактерий вырабатывать протеолитические ферменты;

4) разнообразие видового состава протеолитиков в составе некробиома.

Ограничения, связанные с использованием бактериологических методов исследования ввиду доказанного присутствия в природных сообществах микроорганизмов так называемых некультивируемых форм, или Verrucomicrobia, восполняются использованием высокопроизводительного секвенирования для объективной оценки изменения состава некробиома во времени [11, 12]. Таким образом, применение методов пиросеквенирования гена 16S рРНК [13, 14] и высокопроизводительного секвенирования чрезвычайно важно для получения полной характеристики архейных, бактериальных сообществ, а также сообществ низших грибов в составе некробиомов, что позволило дополнить перечень описанных таксонов в составе некробиома трупа.

Молекулярно-генетическое исследование протеолитиков в составе некробиома предполагает следующее:

1) исследование видового состава протеолитиков, населяющих труп. Его проводят с помощью идентификации и количественного подсчета генетического материала;

2) описание структуры сообщества протеолитиков в составе некробиома;

3) описание топографического разнообразия протеолитиков, обитающих в разных анатомических нишах трупа человека, с помощью филотипирования гена 16S рРНК;

4) оценка экспрессии генов (степень их активности);

5) составление на основании результатов анализа персонализированных рекомендаций по срокам путрификации.

Основные методы изучения протеолитиков в составе некробиома предполагают включение в их комплекс молекулярно-генетических исследований:

1) культивирование на элективных и дифференциально-диагностических средах;

2) световую микроскопию;

3) электронную микроскопию;

4) молекулярно-генетические методы;

5) окрашивание специфическими пробами с последующим микроскопированием (FISH − флуоресцентная гибридизация in situ);

6) методы на основе рестрикционного анализа;

7) методы на основе анализа повторяющихся последовательностей генома;

8) секвенирование генома или отдельных генов, в том числе высокопроизводительное секвенирование NGS (Next Generation Sequencing);

9) полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

При изучении микробиологических особенностей разложения трупа провели пробную серию исследований с применением дискретных методов. В результате в составе посмертного микробиома трех видов животных обнаружили бактерии рода Bacillus, идентифицированные по комплексу морфологических, культуральных, физиологических и биохимических признаков. Максимальная численность бацилл в составе некробиома свиньи составила 18,25% к 4-м суткам разложения, в составе некробиома и ложа трупа мыши — 39,65% к 23-м суткам и в составе некробиома и ложа трупа курицы — 27,13% к 44-м суткам разложения трупа.

Для выделенных изолятов детектировали ПЦР-фрагменты генов 16S рРНК с бактериальными парами универсальных праймеров (11f—1100r) и (11f—1492r). Определили практически полную последовательность бактериального компонента амплификата гена, кодирующего 16S рРНК. Результаты молекулярно-генетической дифференцировки выделенных штаммов с помощью BLAST-анализа последовательности ПЦР-продуктов приведены в таблице. Установили 2 вида филогенетически близкородственной группы − Bac. cereus и Bac. subtilis с идентичностью нуклеотидов на 99,93 и 99% соответственно. Дифференцировали 3 подвида Bac. subtilis: Bac. subtilis subsp. subtilis, Bac. subtilis subsp. inaquosorum и Bac. subtilis subsp. spizizenii.

Таблица. Результаты генотипирования выделенных штаммов

Полученные данные доказывают, что генотипирование необходимо для определения таксономической принадлежности природных штаммов рода Bacillus, обладающих большим спектром вариабельности морфологических и физиолого-биохимических признаков. Результаты пробной серии исследования позволяют также обосновать необходимость проведения дальнейшей экспериментальной работы.

Микроорганизмы могут обеспечить новый метод оценки постмортального интервала. На ряде примеров экспериментальных биологических моделей показано, что изменения посмертного микробного сообщества измеримы и воспроизводимы, помогают достоверно оценить продолжительность посмертного периода вместе с результатами традиционных методов, применяемых в практике судебно-медицинской экспертизы.

Анализ специфических свойств отдельных штаммов протеолитиков может определить возможность и успешность применения этих свойств в судебно-медицинской практике для интерпретации конкретных криминальных ситуаций [15]. Результатом таких исследований может стать разработка динамических моделей сукцессии отдельных микроорганизмов или их эколого-физиологических групп в процессе разложения трупа либо динамики концентрации микроорганизмов и иных количественных показателей изменения некробиома.

Подобный комплексный подход к решению задачи установления сроков позднего постмортального периода позволит обосновать факт, что прижизненная микрофлора каждого человека чрезвычайно уникальна и существует значительный фенотипический полиморфизм известных видов бактерий, населяющих ткани человека при жизни. Полученная с помощью генетического анализа комбинация фено- и генотипов бактериофлоры человека до и после смерти поможет выявить биологические закономерности и ее (фено- и бактериофлоры) динамику в зависимости от вариабельности индивидуальных изменений в процессе раннего и позднего разложения тканей трупа.

Следует отметить, что постмортальная микробиология является новой областью исследований и требует проведения более тщательных экспериментальных изысканий для полного анализа структуры микробного сообщества как инструмента объективной оценки посмертного интервала. Дальнейшее изучение микрофлоры костных останков позволит выйти за рамки эмпирического подхода и получить объективно измеряемые переменные, применимые как для ретроспективных, так и для экспериментальных исследований в области судебной медицины.

Кроме прикладного значения, исследования некробиома необходимы для развития фундаментальных знаний в области сложных процессов конструктивного и энергетического микробного метаболизма, а также экологических закономерностей, лежащих в основе разложения органической материи. Заметные пробелы в знаниях включают необходимость представить подробную каталогизацию микробных таксонов и эколого-физиологических групп, участвующих в процессах разложения; динамику биоразнообразия микроорганизмов при различных климатических, географических, сезонных характеристиках, а также филогении хозяина; метаболическую последовательность микробного разложения и зависимость от физико-химических факторов среды, в том числе температуры, кислотности и влажности.

Заключение

Микробное разложение трупа и его фрагментов — универсальный процесс, поскольку представляет собой среду обитания, которую заселяет специализированное микробное сообщество, способное разлагать высококонцентрированный источник белков и липидов, а не полисахариды, полученные из растений как источника детрита. Представляется перспективным дальнейшее развитие исследований в данном направлении с целью обоснования и широкого применения микробиологических методов в судебно-медицинской практике, а также формирования объективной научной базы для установления причинно-следственных закономерностей микробной трансформации органического вещества в природе. Для этого целесообразно применять комплекс методов, включающий традиционный микробиологический анализ в сочетании с молекулярно-генетическими исследованиями.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема №0752-2020-0007) и реализации Программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017—2021 гг.