Сравнительная характеристика методик ферментативного гидролиза для изолирования токсичных веществ из цельной крови и волос

По данным статистики, каждый год во всем мире, в том числе и в нашей стране, возрастает потребление наркотических средств и психотропных веществ, тяжелые отравления которыми приводят к серьезной угрозе здоровью человека. Нередко с немедицинской целью употребляют и лекарственные препараты [1, 2], производные гамма-аминомасляной кислоты (фенибут, баклофен, мельдоний, прегабалин). Для диагностики острых отравлений наиболее информативной биологической жидкостью является кровь. Токсичное вещество, поступая в организм различными путями, присутствует в крови в свободном или связанном с белком состоянии. Химико-токсикологическое исследование крови позволяет судить о наличии и фактическом содержании токсикантов в организме в определенный момент времени [3, 4]. Для мониторинга длительного приема того или иного вещества в качестве биологического объекта используют волосы, так как ксенобиотики накапливаются в их структуре, не подвергаясь метаболитическим изменениям. Это позволяет установить давность и продолжительность приема психоактивных или других лекарственных веществ [5—7].

Наиболее важным этапом химико-токсикологических исследований и судебно-химической экспертизы является изолирование ксенобиотиков из биологического объекта. Применяемые в лабораториях методики выделения токсичных веществ, например, из крови, позволяют извлечь только свободную фракцию токсиканта, без учета связанной с белками крови фракции. Это существенно снижает эффективность лабораторной диагностики острых и хронических отравлений. Кроме того, некоторые методы пробоподготовки могут приводить к потере целевого токсиканта, например фенибута, который способен образовывать внутреннюю соль и не извлекается из биожидкостей традиционными методами, например, прямой жидкость-жидкостной экстракцией (ЖЖЭ).

В связи с этим изолирование из биологического материала фенибута и таких близких ему по химическому строению веществ, как прегабалин, баклафен, габапентин, затруднено или получают «грязный» экстракт, т.е. извлечение с сильным матричным эффектом. Это происходит при использовании кислотного или щелочного гидролиза, что существенно затрудняет диагностику отравлений данными веществами [6—8]. Одним из перспективных направлений является разработка методик ферментативного гидролиза, включая расширение номенклатуры возможных к использованию ферментов [6, 7], например исследование фермента гиалуронидазы. В литературе имеются сведения о возможности применения гиалуронидазы, но методики и результаты исследований отсутствуют.

Цель исследования — разработка методик ферментативного гидролиза гиалуронидазой для изолирования лекарственных веществ из биологических объектов (кровь, волосы) и сравнение их эффективности с разработанными ранее методиками.

Для эксперимента использовали модельные лекарственные вещества (МЛВ) — субстанции фенобарбитала, дифенгидрамина гидрохлорида, фенибута, для проведения гидролиза — ферменты: папаин (ЗАО «Вектон»), химотрипсин, химопсин и лидазу (ООО «Самсон-Мед»), субстанции трилона Б (чда) и цистеина, оксигент 6% Estel Professional De Luxe, обесцвечивающую пудру для волос Estel Princess Essex Bleaching Power, крем-краску для волос ESTELPROFESSIONAL 10/45 DELUXE, шампунь Estel DeLuxe Hair Shampoo Intensive Clearing, бальзам-стабилизатор цвета для окрашенных и обесцвеченных волос Estel Essex Color Saver Conditioner. Исследования проводили на приборе ГХ-МС фирмы «Agilent 5977 MSD», управление — с помощью программы MassHunter GC MS. Полученные данные обрабатывали в программах Chemstation DataAnalysis, AMDIS, MassHunter Qualitative Analysis и MassHunter Quantitative Analysis [6, 8].

Для моделирования длительного употребления лекарственных веществ использовали лабораторных животных — морских свинок-самцов черного, рыжего и белого природного окраса в возрасте около 6 мес со средней массой тела 0,5 кг и донорскую кровь. Лабораторных животных содержали в экспериментально-биологической клинике согласно требованиям международной системы правил и требований к лабораториям, которые занимаются изучением воздействия новых химических соединений на окружающую среду и здоровье человека (Good Laboratory Practice, GLP) [9—11].

Эксперимент. Модельные смеси крови с растворами МЛВ готовили по методике С.И. Чегера, а также в соответствии с исследованием Н.А. Чувиной [7, 12]. В центрифужные пробирки помещали по 2,5 мл крови и добавляли по 2,5 мл раствора МЛВ: дифенгидрамина гидрохлорид в фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 500 мкг/мл, фенобарбитал в фосфатном буфере pH 7,4 в концентрации 1 мг/мл, 0,5% раствор фенибута в фосфатном буфере pH 7,4. Пробы термостатировали при температуре 37 °С в течение 1 ч [6].

На протяжении 6 мес лабораторные животные черной, рыжей и белой природной окраски ежедневно перорально через зонд получали 0,1% раствор фенобарбитала, 0,1% раствор димедрола и 0,1% раствор фенибута в количестве, соответствующем суточной дозе для человека в пересчете на массу тела лабораторного животного. Отбор шерсти у животных производили по разработанной ранее и апробированной методике каждый 28-й день эксперимента [6, 13, 14]. Предварительно шерсть животных природной черной и рыжей окраски, получавших раствор фенобарбитала и димедрола, обесцвечивали, а шерсть белых животных окрашивали в черный цвет с помощью профессиональной краски для волос. Перед забором шерсти туловище животного условно делили пополам по спинке. Шерсть одной половины спинки окрашивали красителем, а вторую половину оставляли природного окраса. Краситель готовили согласно инструкции [13].

Обесцвечивание проводили следующим способом: с помощью мерной ложки отмеряли 1 часть обесцвечивающей пудры (30 г), мерным стаканом отмеряли 2 части 6% оксигента (60 г) для обесцвечивания черной шерсти и 2 части 3% оксигента (60 г) для обесцвечивания рыжей шерсти, все тщательно перемешивали до образования однородной массы [14, 15].

Смесь для окрашивания или обесцвечивания в зависимости от природной окраски шерсти наносили на половину тела животного, выдерживали 5—10 мин, затем краску смывали теплой водой с шампунем Estel DeLuxe Hair Shampoo Intensive Clearing. После этого шерсть животных обрабатывали бальзамом-стабилизатором цвета Estel Essex Color Saver Conditioner и смывали бальзам. Шерсть животных сушили феном. Отбор шерсти производили путем состригания ее хирургическими ножницами максимально близко к коже. Средняя масса навески шерсти морских свинок составила от 8 до 14 г. Полученные навески шерсти отмывали от внешних загрязнений водой очищенной и метанолом, высушивали при комнатной температуре, затем измельчали в шаровой мельнице в течение 10 мин при 25 гГц.

Гидролиз гиалуронидазой модельного образца кровь—МЛВ проводили по следующей методике: к 5 мл образца добавляли 5 мл 0,2% раствора гиалуронидазы в ацетатном буфере при pH 4,5. Пробы термостатировали при температуре 37 °С 3 ч. Затем пробы охлаждали и центрифугировали, центрифугат отбирали. Для комплекса кровь—фенибут параллельно проводили гидролиз химопсином по методике, разработанной Н.А. Чувиной: к 5 мл образца добавляли 5 мл 0,2% раствора фермента в 0,1 М растворе аммония гидрокарбоната. Смесь выдерживали при температуре 37 °ºС в течение 1 ч.

После окончания времени инкубации изолирование фенобарбитала и дифенгидрамина проводили методом ЖЖЭ хлороформом при рН 2,0 для фенобарбитала и рН 10,0—11,0 для дифенгидрамина [6].

Основание фенибута из модельного образца крови извлекали методом прямого экстракционного вымораживания (ПЭВ) с ацетонитрилом: образец центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин, центрифугат отбирали. В центрифугате устанавливали последовательно оптимальное значение рН 2,0—6,0—10,0 и добавляли ацетонитрил в соотношении 1:1, перемешивали 15 мин на мультиротаторе MultiBioRS-24 при 50 об/мин без виброрежима. Полученные образцы еще раз центрифугировали со скоростью 2000 об/мин в течение 10 мин, помещали в морозильную камеру (от –18 до –22 °С) на 30—40 мин и отбирали верхний слой ацетонитрила. Экстрагировали 3 раза для каждого значения рН. Ацетонитрильные извлечения объединяли и выпаривали [16].

Гидролиз гиалуронидазой образцов шерсти природного окраса и после косметического воздействия проводили по следующей методике: к точной навеске шерсти около 0,4 г добавляли 4 мл 0,2% раствора фермента в ацетатном буфере и термостатировали при температуре 37 °С в течение 3 ч, затем пробы центрифугировали при 2000 об/мин 10 мин и центрифугат отбирали. К осадку добавляли вторую порцию раствора гиалуронидазы и инкубировали следующие 3 ч. Процедуру центрифугирования повторяли. Суммарное время гидролиза составило 6 ч [6]. Далее извлекали МЛВ по ранее представленным методикам.

Полученные сухие остатки растворяли в комплексном растворителе (дихлорметан, дихлорэтан, гептан, пропанол-2 в соотношении 1:1:1:0,5) и исследовали методом ГХ-МС на хроматографе «Agilent 7890 A» с масс-селективным детектором 5977 MSD на колонке HP — 5ms (30 м × 0,35 мм × 0,35 мкм). Ввод 1 мкл пробы автоматический. Условия анализа: газ-носитель гелий, скорость потока через колонку 0,8 мл/мин, температура испарителя 280 °С, температура интерфейса МС детектора 290 °С, температура колонки программируемая: начальная — 80 °С в течение 0,4 мин, нагревание со скоростью 50 °С/мин до 100 °С, далее 30 °С/мин до 300 °С с выдержкой при конечной температуре 5 мин. Режим сканирования по полному ионному току в диапазоне масс 40—500 m/z (атомные единицы массы). Полученные хроматограммы обрабатывали в программах Chemstation Data Analysis, Qualitative MassHunter Analysis, AMDIS. Методики количественного определения МЛВ валидированы, расчет вели по градуировочным графикам [6].

Исследование проводили с МЛВ, различающимися по физико-химическим свойствам, прежде всего кислотно-основным (фенобарбитал — кислотные, дифенгидрамин — основные, фенибут — амфотерные), и липофильности [17], что позволило охватить широкий спектр лекарственных веществ с различными свойствами. При исследовании экстрактов из крови на хроматограммах обнаружили пики нативных молекул фенобарбитала, дифенгидрамина и 4-амино-3-фенилбутановой кислоты, масс-спектры которых совпали с данными библиотек с вероятностью не менее 85% (см. рисунок). Результаты определения количественного содержания веществ в экстрактах после гидролиза крови (табл. 1) показали, что степень экстракции фенобарбитала после гидролиза гиалуронидазой ниже результатов, полученных после гидролиза неспецифическими протеолитическими ферментами, например химопсином [7, 12].

Для дифенгидрамина можно отметить несущественную разницу в результатах, полученных после гидролиза гиалуронидазой и химопсином. Гиалуронидаза, несмотря на высокий процент связывания основания димедрола с белками крови (до 90%), вероятно, способна гидролизовать связи именно тех аминокислотных фрагментов альбумина крови, которые обеспечивают наибольшее связывание дифенгидрамина [18].

Фенибут является гидрофильным амфотерным веществом, в гидрофильной среде образует цвиттер-ион, поэтому использовали метод ПЭВ. Анализ экстрактов, содержащих основание фенибута, показал, что наибольшее количество 4-амино-фенилмасляной кислоты извлекается из проб после гидролиза химпосином и последующей экстракцией ацетонитрилом при рН 2,0 и рН 6,0. Ошибка метода при данных значениях рН превышает коэффициент приемлемости 15% (табл. 2). При гидролизе гиалуронидазой получили неудовлетворительные результаты по сравнению с методикой изолирования химопсином вследствие также наименьшего сродства фермента гиалуронидазы к субстрату — белки крови.

На хроматограммах экстрактов из образцов шерсти природного окраса и после косметического воздействия также обнаружили пики нативных молекул МЛВ с характерными масс-спектрами, которые совпали с данными библиотек прибора.

При сравнении полученных результатов выявили, что количественное содержание фенобарбитала в природно и искусственно окрашенной шерсти после гидролиза гиалуронидазой незначительно меньше, чем после гидролиза протеолитическими ферментами (химопсином). Количество дифенгидрамина в экстрактах после гидролиза гиалуронидазой в 2—3 раза меньше, чем после протеолитического гидролиза.

Для диагностики длительного употребления фенибута предложена методика ферментативного гидролиза гиалуронидазой и папаином шерсти (волос) рыжего, черного природного и искусственного окраса. Фенибут в волосах обнаружен впервые (см. табл. 2).

Определены некоторые валидационные параметры (селективность, сходимость и робастность) для предложенных методик ферментативного гидролиза цельной крови и шерсти (волосы), соответствующие критерию приемлемости. Это позволяет рекомендовать данные методики для практического использования в химико-токсикологических лабораториях и судебно-химических отделениях.

Таким образом, предлагаемая методика гидролиза гиалуронидазой показала удовлетворительные результаты при исследовании крови, природно и искусственно окрашенных образцов шерсти. Это позволяет рекомендовать ее для изолирования веществ кислого, амфотерного и основного характера шерсти различного природного и искусственного окрашивания и крови. Для разработанных методик изолирования МЛВ из крови и шерсти гиалуронидазой определены некоторые валидационные показатели: специфичность, сходимость и робастность.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.