Определение интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД в скелетной мышце крысы в зависимости от давности наступления смерти

Проблема определения давности наступления смерти, возникшая на первых этапах становления судебно-медицинской танатологии, не потеряла своей актуальности и в настоящее время. Многочисленные исследования, проводимые с целью усовершенствования диагностики давности наступления смерти, не внесли значимых изменений в экспертную практику. Уже более 150 лет для решения вопроса давности наступления смерти используется термометрический метод в сочетании с исследованием трупных изменений [1]. Следственные органы заинтересованы в максимальной объективности и точности экспертных выводов по вопросу о давности наступления смерти, а также в правовой, медицинской, биологической значимости данного вопроса. В связи с этим необходимо тщательное изучение механизмов и закономерностей процессов посмертного периода с применением современных методов, используемых в медицине и смежных с ней науках. Г.В. Шор в монографии «О смерти человека (введение в танатологию)» высказал «пожелание, чтобы к разработке танатологической проблемы приступили представители различных научных дисциплин, т.к. только полигранная разработка этих вопросов сможет внести ясность в учение о смерти» [2]. Написанное Г.В. Шором в 1925 г. как нельзя лучше обозначает направление развития современной судебно-медицинской танатологии.

Одним из примеров «полигранной» разработки критериев для более точного определения давности наступления смерти является применение биофизических методов, широко используемых в исследовательских работах с конца 60-х годов. Электронный парамагнитный резонанс, хемилюминесценция, спектрофотометрия, электропровод-ность, комплексная относительная диэлектрическая проницаемость позволили исследователям выявить зависимые от давности наступления смерти изменения окислительно-восстановительных процессов в тканях и показать возможность применения данных методов для определения сроков посмертного периода [3—5]. Биофизические методы в судебной медицине также применяются для определения давности и прижизненности травмы, диагностики причин скоропостижной смерти [3, 6, 7].

Одно из перспективных направлений, на наш взгляд, — изучение окислительно-восстановительных процессов в различные сроки посмертного периода на основании исследования коферментов НАДН и ФАД методом лазерно-индуцированной флуоресцентной спектроскопии. Коферменты НАДН и ФАД участвуют в широком спектре внутриклеточных окислительно-восстановительных реакций. Они выполняют ключевую роль в реакциях образования АТФ, являясь донорами и акцепторами электронов [8]. НАДН локализован в митохондриях и участвует пре-имущественно в энергетическом обмене клетки. ФАД, находясь в митохондриях и цитозоле клеток, задействован не только в процессе окислительного фосфорилирования, но и принимает участие в аскорбатглутатионовом и пентозофосфатном циклах, антиоксидантных реакциях, синтезе ацетилкоэнзима А, липогенезе, утилизации глутатиона, перекисном окислении липидов [9, 10]. Способность данных коферментов к аутофлуоресценции в ультрафиолетовом и синем спектрах обусловливает их диагностическую значимость, заключающуюся в возможности анализа тканевого метаболизма на основании изменений интенсивности флуоресценции, что нашло применение в клинических исследованиях [11, 12].

Явление флуоресценции молекул НАДН и ФАД основано на испускании возбужденными молекулами нетепловых квантов света под воздействием излучения ультрафиолетового и синего спектров соответственно. Регистрация длин волн испускаемых квантов света при зондировании ткани лазерным излучением является основой флуоресцентной спектроскопии [13, 14].

Цель исследования — выявить закономерности изменения интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД в скелетной мышце крысы в первые сутки после наступления смерти.

Эксперимент проводили на крысах самках и самцах (n=20) линии Sprague Dawley массой тела 250—300 г в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Протокол эксперимента одобрен локальным биоэтическим комитетом ФНКЦ Р.Р. Эвтаназию животных осуществляли цервикальной дислокацией под общей анестезией хлоралгидратом. Перед экспериментом животных содержали в одинаковых условиях. Выделили 4 группы по 5 животных в каждой. Интенсивность флуоресценции коферментов НАДН и ФАД и редокс-отношение (НАДН/ФАД) — РО регистрировали при жизни под общей анестезией, через 5 мин после смерти и каждые 1,5 ч в течение первых суток посмертного периода.

В 1-й группе измерения проводили при жизни под общей анестезией, через 5 мин после смерти, каждые 1,5 ч в течение 6 ч посмертного периода; во 2-й группе — каждые 1,5 ч с 7,5 до 12 ч; в 3-й группе — каждые 1,5 ч с 13,5 до 18 ч; в 4-й группе — каждые 1,5 ч с 19,5 до 24 ч.

Трупы животных в период проведения эксперимента находились при комнатной температуре. Для оценки интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД использовали лазерный диагностический аппарат Лазма МЦ-3 (№ РЗН 2015/3142 от 29.10.2015; ООО НПП «Лазма», Россия) с зондирующем излучением и длиной волны 365 нм (UV) и 450 нм (B).

Доступ к мышце бедра крысы — через разрез кожи длиной 1 см, волоконно-оптический зонд анализатора коферментов устанавливали на участок поверхности скелетной мышцы. Измерение показателей проводили в течение 4 мин у каждого животного.

Показатели фиксировали и сохраняли в ПК с программным обеспечением к аппарату Лазма МЦ-3. Статистический анализ осуществляли непараметрическим методом (U-test Mann—Whitney) с помощью пакета статистических программ Statistica 6. Различия принимали статистически значимыми при р<0,05.

С 5-й минуты посмертного периода до 3 ч наблюдали постепенное возрастание интенсивности флуоресценции НАДН. Максимальные значения интенсивности флуоресценции НАДН зафиксировали через 3 ч после наступления смерти. Постепенное снижение интенсивности флуоресценции НАДН зарегистрировали с 4,5 до 24 ч посмертного периода (рис. 1).

Полученные результаты можно объяснить механизмами окислительного метаболизма при дефиците кислорода. В условиях аноксии в клетке запускаются реакции анаэробного гликолиза, в результате которого НАД+ восстанавливается до НАДН с образованием пирувата и АТФ [10, 15]. Увеличение интенсивности его флуоресценции происходит вследствие накопления НАДН, окисление которого становится невозможным из-за отсутствия кислорода. Основной вклад в флуоресценцию вносит связанная с белками форма НАДН, локализованная в митохондриях [16]. В связи с этим уровень интенсивности флуоресценции снижается после 3 ч, согласно нашим предположениям, за счет раз-общения связи кофермента с белками в результате активизации протеолитических ферментов.

Значения коэффициентов интенсивности флуоресценции ФАД в первые 4,5 ч менялись незначительно. Через 5 ч после смерти зарегистрировали их снижение. Возрастание величины коэффициентов флуоресценции ФАД отметили с 9 ч посмертного периода (рис. 2),

Известно, что ФАД находится внутри электрон-транспортного флавопротеина, а при высвобождении из него флуоресцирует в разы интенсивнее [16, 17]. В данном случае можно предположить, что зафиксированное увеличение интенсивности флуоресценции ФАД через 24 ч после смерти связано с распадом флавопротеина под действием протеолитических ферментов в процессе аутолиза.

Возрастание отношения коэффициентов флуоресценции НАДН к ФАД — редокс-отношение (РО) регистрировали с 5-й минуты до 3 ч посмертного периода включительно. С 4,5 и до 24 ч наблюдали постепенное снижение РО (рис. 3).

Отметили также, что РО>1 в первые 9 ч после смерти, а в интервале 9—24 ч РО<1.

В представленном исследовании наиболее показательными результатами являются резкое возрастание флуоресценции НАДН к 3 ч посмертного периода и постепенное ее снижение к концу первых суток; преобладание флуоресценции НАДН над ФАД до 9 ч посмертного периода, а также значимое возрастание флуоресценции ФАД к концу первых суток. Выявленная тенденция изменения интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД в скелетной мышце экспериментальных животных в течение первых суток посмертного периода позволяет рассматривать этот показатель в качестве потенциального критерия определения давности наступления смерти. Очевидна необходимость проведения данного исследования на трупах людей.

На флуоресцентную активность коферментов в тканях трупа, возможно, влияют условия окружающей среды и вид смерти. Следовательно, необходимы последующие исследования для оценки влияния данных факторов на этот показатель.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.