До появления молекулярно-генетических методов анализа центральное место в экспертизе вещественных доказательств занимало установление принадлежности тканей и выделений человека по системе АВ0 путем выявления соответствующих антигенов иммунологическими методами. Установление группы крови не несет идентифицирующей информации, однако представляется важным определять принадлежность биологических объектов к основным группам системы АВ0, которая указывается в медицинских картах и является, таким образом, установочным признаком. Выявление групповой принадлежности биологических следов, изъятых на месте преступления или с вещественных доказательств, позволит скорректировать направление поисковых мероприятий и провести скрининг при большом количестве подозреваемых.
За последние годы появилось большое количество сообщений о различных молекулярно-генетических способах установления групповой принадлежности [1—8].
Иммунологический подход, использующийся при проведении судебно-медицинской экспертизы (СМЭ), имеет определенные недостатки: возможность неспецифических взаимодействий используемых антител, присутствие иных антигенов со схожей иммунологической специфичностью (загрязнение образцов микробной флорой, биоматериалом животных), смешение биологического материала от разных лиц, трудности в типировании различных вариантов подгрупп системы АВ0, модификации антигенных структур под влиянием окружающей среды. Все это может привести к ошибочной интерпретации результатов [9].
Указанные факторы не влияют на результаты определения молекулярно-генетическим методом, поскольку анализируется ген, ответственный за биосинтез антигена. Преимущества такого подхода очевидны: возможность выявления редких вариантов, универсальность для объектов экспертизы любого происхождения, содержащих ядерную ДНК человека, полнота характеристики исследуемого признака по сочетанию наследуемых от обоих родителей аллелей.
Таким образом, для установления групповой принадлежности криминалистических образцов применение ДНК-анализа является предпочтительным [1]. Данный подход актуален при исследовании микрообъектов, поскольку весь имеющийся биологический материал можно использовать для генетического исследования, в рамках которого проводится установление группы крови по системе АВ0 [10].
Применение ДНК-анализа стало возможным после изучения структуры гена АВ0, начатого F. Yamamoto и соавт. [11].
Экспрессию антигенов, А и В контролируют аллели гена АВ0, расположенного на 9-й хромосоме в позиции 9q34 (см. схему). При наличии аллеля, А образуется N-ацетилгалактозаминилтрансфераза, которая переносит N-ацетилгалактозамин на фукозилированный остаток галактозы Н-антигена. Таким образом формируется А-активная структура антигена. При наличии аллеля В образуется фермент галактозилтрансфераза, переносится галактоза и формируется В-активная структура. При наличии аллеля 0 активный фермент не продуцируется, Н-структура остается в неизмененном состоянии [12].
Известно около 88 аллельных вариантов гена АВ0 [13, 14]. Высказано предположение, что ген А является геном-предшественником, что позволяет объяснить наличие большого количества фенотипических вариантов в А-группе и сравнительно малое количество в группе В [11]. В целом для отнесения образца к одной из четырех фенотипических групп можно выделить наиболее значимые мутации (относительно последовательности гена А). Они сосредоточены в экзонах 6 и 7, наибольших по размерам и содержащих 77% кодирующей последовательности. В экзоне 6 делеция гуанидина в позиции 261, характерная для аллеля 0, приводит к сдвигу рамки считывания и синтезу неактивного фермента, что выражается в неизменности структуры антигена Н. Замены 297А/G, 526С/G и 802G/A в экзоне 7 при отсутствии делеции 261G, что характерно для аллеля 03, приводят к потере трансферазной активности. Кроме того, в экзоне 7 расположены несколько точек полиморфизма, мутации по которым проявляются в изменении структуры фермента и в конечном счете в синтезе антигена В. Этим объясняется ориентированность многих тест-систем именно на эти два участка [1—8]. В табл. 1 приведены позиции полиморфизма в экзонах 6 и 7, определяющие основные варианты.
При разработке дизайна тест-систем, как правило, используют определенные точки полиморфизма. Всегда исследуют позицию 261 как определяющую фенотип 0 (I). Для более полного установления этого фенотипа среди белых европейцев выявляют мутацию 802G/A, которая при отсутствии делеции 261G указывает на аллель 03 [2—4]. Дополнительно исследуют один или несколько полиморфизмов, характерных для аллеля В: 526C/G, 703G/A, 796C/A, 803G/C.
В данной статье представлен опыт применения отечественной тест-системы для установления групповой принадлежности по системе АВ0 методом SNP-анализа.
Материал и методы
Тест-система: набор реактивов для обнаружения полиморфизмов гена АВ0 АВ0-детект (ЗАО «Синтол», Москва) позволяет установить в препарате ДНК наличие или отсутствие трех бинарных мутаций в экзонах 6 и 7 гена АВ0.
Группу крови определяли по нуклеотидным заменам в точках 261, 796 и 802 с использованием аллельспецифичных зондов, меченных различными флуорофорами. Гибридизация с ДНК образца происходит только в случае полной комплиментарности зонда и матрицы, т. е. только на участке, содержащем однонуклеотидную замену. На этапе элонгации цепи Taq-ДНК-полимераза за счет своей 5’—3’-экзонуклеазной активности отщепляет флуорофор присоединенного зонда. Разрушение зондов усиливает сигналы флуоресценции соответствующих красителей. При отсутствии мутации гибридизации зонда и его последующего расщепления не происходит. Таким образом достигается специфичность определения полиморфизма SNP.
В процессе разработки специалистами ЗАО «Синтол» проведено секвенирование полиморфных участков и опробованы различные варианты дизайна тест-системы.
В тест-системе используются две реакционные смеси: АВ0-Ех6 и АВ0-Ех7, причем для автоматического определения групповой принадлежности исследование необходимо проводить в одной постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Точки полиморфизма, соответствующие аллельные состояния гена и красители приведены в табл. 2.
С использованием реакционной смеси АВ0-Ех6 проводят исследование полиморфизма 261 G/dеl в экзоне 6. Делеция 261dеl соответствует аллелю 0. В реакционную смесь введены соответствующие двум аллельным состояниям зонды, меченные красителями R6G (261G) и ROX (261dеl).
С использованием реакционной смеси АВ0-Ех7 проводят исследование позиций 796 С/А и 802 G/А в экзоне 7, мутации по которым обусловливают аллельные состояния В и 03. Сообщений об обнаружении аллеля 03 В гомозиготном состояниив литературе нет, поэтому принято считать, что аллель 03существует только в гетерозиготном состоянии. В реакционную смесь введены соответствующие различным аллельным состояниям зонды, меченные красителями R6G (796С), ROX (796А) и Су5 (802А).
В каждой пробирке проходит реакция по внутреннему положительному контролю (ВПК), которая позволяет выявить ингибирование ПЦР и исключить ложноотрицательные результаты. Соответствующий зонд мечен красителем FAM.
В качестве положительных контрольных образцов (ПКО) в набор реагентов входят водно-буферные растворы, содержащие соответствующий специфический фрагмент ДНК и позволяющие оценить положительную динамику изменения флуоресценции, характерную для различных аллельных состояний.
Оборудование для проведения анализа: анализатор для обнаружения нуклеиновых кислот методом ПЦР в реальном времени АНК-32 или АНК-32М (ИАП РАН, Санкт-Петербург) [15].
Для автоматизации процессов детекции реакций и интерпретации данных используют специализированное программное обеспечение. При отсутствии шаблона расчета, либо при необходимости проверки результатов обработка данных может быть проведена в ручном режиме (табл. 3).
Исследуемые образцы:
— 200 образцов донорской крови, полученные из коллекции ФГБУ ГНЦ Минздрава России с заведомо известным АВ0-фенотипом;
— образцы буккального эпителия 20 известных лиц;
— образцы крови 5 известных лиц;
— окурки сигарет от 10 известных лиц;
— образцы корневой части волос двух известных лиц;
— образцы крови 10 неопознанных лиц с известной групповой принадлежностью;
— криминалистические объекты (следы крови — 45 шт., окурки — 10 шт., следы пальцев рук на липкой ленте — 6 шт., влагалищные тампоны — 2 шт., следы на одежде — 5 шт., выделения на носовом платке — 1 шт., волосы — 4 шт.), всего 73 шт.
Препараты ДНК получали с помощью различных методов выделения ДНК:
— из образцов буккального эпителия, окурков сигарет и корневой части волос с использованием ионообменной смолы Chelex 100 Resin («Bio-Rad Laboratories», США);
— из крови, следов на липкой ленте, следов на одежде, выделений на носовом платке с помощью набора реагентов DNA IQ System («Promega Corporation», США);
— из следов на влагалищных тампонах с помощью наборов реагентов Differex System, DNA IQ System («Promega Corporation», США).
Иммунологические методы. Групповую принадлежность следов крови, выделений из носа и волос устанавливали с помощью реакции абсорбции-элюции (РАЭ) [16—18], следов слюны — по результатам иммуноферментного анализа в дот-варианте (дот-ИФА) [19].
В исследовании использовали моноклональные антитела (МКА) 3 фирм: ООО «Гематолог» (Россия), «Biotest» (Германия) и «Ortho-Clinical Diagnostics» (США), а также набор Группоспот (ООО «Гематолог»).
Результаты и обсуждение
В ходе разработки тест-системы принципиальная возможность отнесения образцов по четырем основным группам крови была проверена на 200 образцах донорской крови, полученных из коллекции ФГБУ ГНЦ Минздрава России.
Получили следующее распределение по групповой принадлежности: АА — 16%, А0 — 20,5%, ВВ — 7,5%, АВ — 7,5%, В0 — 14,5%, 00 — 34%. Результаты определения молекулярно-генетическим методом соответствовали заявленному фенотипу. Методы, использующиеся в клинической практике ФГБУ ГНЦ Минздрава России, не позволяют выявлять слабые и редко встречающиеся варианты, А (II) и В (III). В связи с этим провести сравнительное тестирование на таких образцах не представилось возможным.
При разработке тест-системы первоначально были выбраны позиции 261 и 796, анализ которых позволяет выявлять аллели 0 и В. Позже дизайн тест-системы доработали: расширили диапазон определения полиморфизмов путем введения зонда для установления мутации в точке 802 для выявления аллеля 03. При этом референсная последовательность соответствует вариантам А1 и А2, составляющим основную долю фенотипа, А (II).
Изучали возможность применения тест-системы в экспертной практике. Для этого в Институте криминалистики Центра специальной техники ФСБ России проводили параллельное определение групповой принадлежности объектов двумя методами — ПЦР в реальном времени и иммунологическим.
Исследовали следы крови, слюны, выделений из носа и волосы. Групповую принадлежность потожировых следов не определяли, поскольку на основании собственного опыта и данных литературы [20] известна высокая вероятность получения ложных результатов. Все микроследы крови в связи с ограниченным количеством материала исследовали только молекулярно-генетическим методом, что позволило получить как генотип, так и установить группу крови. Для раздельного типирования антигенов системы АВ0 в смеси спермы и влагалищных выделений существует ряд методов: исследование различных фракций, полученных после проведения электрофореза смеси в полиакриламидном геле, иммунофлюоресцентный анализ, определение антигенов спермы после лизиса. Все эти методы часто дают неоднозначные результаты, а следовательно, необходимы неоднократные повторы и использование большого количества исходного биологического материала. В связи с этим имеющийся материал использовали для молекулярно-генетического исследования.
При типировании генетическим и иммунологическим методами для всех объектов (более 100) получили идентичные результаты.
Результаты молекулярно-генетического определения группы крови по препаратам ДНК, полученным из образцов буккального эпителия заведомо известных лиц, а также из окурков и волос от этих же лиц, полностью совпали.
Чувствительность тест-системы определяли в серии разведений препаратов ДНК, полученных из образцов буккального эпителия 10 лиц с известной групповой принадлежностью. Концентрация ДНК составила 1, 0,1, 0,05 и 0,02 нг/мкл.
Автоматическое определение стабильно проходило при концентрации не менее 0,05 нг/мкл. При меньшей концентрации ДНК требовалась дополнительная проверка результатов в ручном режиме.
По результатам измерений установили чувствительность определения разработанной тест-системы — 0,05 нг/мкл. Такая чувствительность является удовлетворительной, так как находится в обычных пределах для молекулярно-генетических исследований, например для генотипирования.
Препараты ДНК, полученные из различных криминалистических объектов, предварительно оценивали количественно и генотипировали. Испытания тест-системы проводили на препаратах с различным содержанием ДНК: 36% составляли препараты с концентрацией более 0,2 нг/мкл; 28% — от 0,2 до 0,05 нг/мкл; 36% — от 0,05 до 0,02 нг/мкл. При исследовании образцов из последней группы обнаружилась та же тенденция, что и при определении чувствительности.
Для определения групповой принадлежности использовали также 10 образцов трупной крови на ватных палочках, поступившие из Московского бюро СМЭ, причем на конвертах для каждого образца была указана группа крови. Определение проводили параллельно на препаратах ДНК исходной концентрации и нормализованных до 0,1 нг/мкл. Результаты совпали между собой и соответствовали указанным на конвертах данным.
В нескольких случаях была возможность дополнительно установить групповую принадлежность по образцам сравнения, предоставленным от потерпевших или подозреваемых. Результаты определений, проведенных по биологическим следам с вещественных доказательств и по образцам сравнения, совпали.
В Институте криминалистики Центра специальной техники ФСБ России по результатам ДНК-анализа получили следующее распределение образцов по групповой принадлежности: АА — 14,3%, А0 — 24,6%, ВВ — 3,4%, АВ — 4,2%, В0 — 19,8%, 00 — 31,2%. Аллель 03 выявили в 3 (2,5%) случаях: 1 раз в сочетании А03 и 2 раза в сочетании 003.
Тест-система не предназначена для определения редко встречающихся вариантов или аллелей, имеющих сайты полиморфизма вне указанных локусов.
В целом можно сделать вывод о корректности определения и возможности введения методики в экспертную практику. Опыт применения тест-системы показал, что предложенный метод обеспечивает специфичность и точность определения даже при малых концентрациях ДНК.
Рекомендации по использованию тест-системы:
— анализ с использованием данной тест-системы надо проводить после количественной оценки препарата ДНК;
— для исследования может быть использован не исходный препарат, а препарат, разведенный до концентрации, необходимой для генотипирования (около 0,1 нг/мкл);
— образцы от заведомо известных лиц могут быть направлены на анализ до генотипирования или одновременно, криминалистические — только после генотипирования и подтверждения индивидуального происхождения.
Проведенные исследования показали, что разработанную тест-систему можно применять для исследования препаратов ДНК индивидуального происхождения, полученных из любых объектов экспертизы, в том числе микрообъектов, содержащих ядерную ДНК человека. В области криминалистики результаты установления групповой принадлежности по системе АВ0 могут быть использованы для дифференциации образцов, а также для получения оперативно-розыскной информации.
Заключение
Таким образом, в практику экспертиз вещественных доказательств необходимо вводить новые методы молекулярной генетики, позволяющие получить максимально полную информацию об объекте без потерь материала. Определение групповой принадлежности следов крови по системе АВ0 с помощью SNP-анализа, на наш взгляд, более целесообразно, чем использование для этой цели иммунологических реакций, особенно при исследовании микроследов.
Конфликт интересов отсутствует.