Разработка и валидация методики количественного определения производных сибутрамина в биологически активных добавках

Серьезной, глобальной по своим масштабам проблемой является незаконный оборот и злоупотребление психоактивными веществами: наркотическими средствами, психотропными веществами, а также сопутствующими им сильнодействующими, ядовитыми веществами и прекурсорами. В России еще далек от совершенства контроль потенциально опасных психоактивных веществ, в том числе сильнодействующих и их производных.

Одним из примеров незаконного оборота сильнодействующих веществ, а также средств, обладающих психоактивными свойствами, является распространение данных веществ под видом биологически активных добавок (БАД) к пище. В последние годы участились случаи обнаружения сибутрамина в составе БАД. Федеральная служба по контролю за оборотом наркотиков РФ сообщала, что с учетом дофаминовой теории формирования наркологических заболеваний, сибутрамин может вызывать привыкание и зависимость, а клинические описания его действия позволяют предположить использование его потребителями психоактивных веществ в качестве психостимулятора. С 2008 г. сибутрамин, а также его структурные аналоги, оказывающие схожее психоактивное действие, включены в список сильнодействующих веществ для целей статьи 234 и других статей Уголовного кодекса Российской Федерации [1].

В настоящее время в БАД незаконно вносятся активные деметилированные метаболиты сибутрамина, синтезированные в виде субстанций. Являясь производными сибутрамина, десметилсибутрамин (ДМС) и дидесметилсибутрамин (ДДМС) значительно активнее исходного соединения [2, 3], их фармакологические свойства до конца не изучены, и поэтому данные вещества потенциально опасны для потребителя. Кроме того, до сих пор не определен правовой статус производных сибутрамина. Данные вещества имеют структурное сходство с амфетамином, внесенным в Список наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров (табл. 1). Ряд зарубежных исследователей [4-6] исключают возможность использования сибутрамина в качестве замены амфетамина или МDМА, ссылаясь на низкий риск возникновения пристрастия к данному препарату.

Согласно действующему законодательству РФ, сильнодействующие вещества и их аналоги запрещены к использованию в составе БАД к пище [7]. К сожалению, в литературе отсутствует какая-либо информация по процедуре контроля БАД на наличие сильнодействующих веществ. В практике судебно-химических исследований имеются факты обнаружения в БАД таких веществ. Практически не встречаются в литературе данные по количественному определению ДМС и ДДМС, незаконно внесенных в состав биодобавок.

В связи с этим актуальна разработка соответствующих методик не только обнаружения указанных веществ в составе БАД, но и их количественного определения.

Цель исследования - разработать и провести валидацию методики количественного определения деметилированных производных сибутрамина в БАД к пище методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ).

Исследование проводили на газовом хроматографе Хроматэк-Кристалл 5000 (Йошкар-Ола, ЗАО СКБ «Хроматэк») с пламенно-ионизационным детектором.

Объектами исследования служили стандартные растворы ДМС и ДДМС в концентрации 1000 мкг/мл в 96% этиловом спирте. В качестве внутреннего стандарта использовали раствор метилстеарата в 96% этиловом спирте в концентрации 1000 мкг/мл. Метилстеарат имеет близкие с исследуемыми веществами хроматографические параметры: хорошо разрешенный пик, расположенный на хроматограмме рядом с пиком определяемого компонента, что дает возможность точного измерения пика, уменьшает влияние изменения чувствительности детектора вследствие колебаний рабочих условий (расход газа-носителя, температура колонки и т. д.). Кроме того, метилстеарат широко используется в качестве внутреннего стандарта в экспертно-криминалистической практике при количественном определении таких наркотических средств, как морфин, кодеин, метадон, фенциклидин, в том числе амфетамин, имеющий структурное сходство с сибутрамином и его производными.

Для определения оптимальных условий хроматографирования анализ проводили в температурных режимах начиная с минимальных:

- температура термостата колонки начальная 120 °C, скорость нагрева до температуры 150 °C - 20 °С/мин, температура детектора 200 °C, температура испарителя 150 °C;

- температура термостата колонки начальная 150 °C, скорость нагрева до температуры 200 °C - 10 °С/мин, температура детектора 230 °C, температура испарителя 200 °C.

В данных программированных временных и температурных условиях, а также при их дальнейшем варьировании при хроматографировании значительно увеличивалось время анализа и выхода пиков исследуемых веществ (до 15 мин), площадь и высота пиков были незначительны, не достигалось эффективного разделения пиков, они не были симметричны. Для получения оптимальных результатов повышали температуру анализа. Таким образом, при проведении эксперимента нами предложены следующие условия хроматографирования:

- колонка HP-5 длиной 30 м;

- скорость потока газа-носителя (азот) 2,4 мл/мин;

- температура термостата колонки начальная 170 °C;

- скорость нагрева до температуры 220 °C - 20 °С/мин;

- температура детектора 250 °C;

- температура испарителя 230 °C;

- ввод пробы с делением потока 1/3;

- объем вводимой пробы 1 мкл.

Валидацию разработанной методики осуществляли на спиртовых растворах ДМС и ДДМС по следующим показателям: специфичность, линейность, правильность, прецизионность (на уровне intra-day и inter-day), аналитическая область.

Для проверки специфичности предложенных условий проанализировали экстракты из БАД растительного происхождения, содержащих ДМС и ДДМС. В качестве примера приводим хроматограмму экстракта БАД, в которой ранее обнаружили ДДМС (см. рисунок). Коэффициент разрешения соседних хроматографических пиков составил более 15, что свидетельствует о приемлемом разделении.

В табл. 2 представлены основные параметры, позволяющие оценить качество хроматографического разделения.

Для характеризации линейности методики готовили растворы исследуемых веществ в 96% этиловом спирте в концентрациях 1000, 500, 200, 100, 50 и 10 мкг/мл в присутствии внутреннего стандарта (раствор метилстеарата в 96% этиловом спирте в концентрации 1000 мкг/мл).

Растворы хроматографировали в разработанных условиях, измеряли площади хроматографических пиков и строили калибровочный график (n=6). Линейная зависимость между концентрацией растворов и площадью хроматографического пика наблюдалась во всем интервале выбранных концентраций (R²_ДМС = 0,9968; R²_ДДМС = 0,9997).

Следующий этап - оценка правильности и прецизионности методики. Хроматографировали по три калибровочных спиртовых раствора ДМС и ДДМС концентрацией 10, 200 и 1000 мкг/мл в течение 1-го (intra-day) и 2-го (inter-day) дня. Каждый раствор хроматографировали в трех повторностях. Для полученных значений концентрации веществ рассчитывали величину стандартного отклонения (SD), относительного стандартного отклонения (RSD, %) и отклонение от заданной величины (ε, %) (табл. 3).

Полученные значения ε свидетельствуют о достаточной степени соответствия между истинным значением определяемого вещества и его значением, рассчитанным по данной методике, а величины RSD не превышают рекомендованное значение в условиях внутрилабораторной прецизионности (≤2%).

На основании результатов оценки линейности, правильности и прецизионности определили интервал аналитической области методики: 10-1000 мкг/мл.

Разработанная методика успешно апробирована на 5 образцах БАД, в которых ранее были обнаружены ДМС и ДДМС (табл. 4). Пробоподготовку проводили при комнатной температуре следующим образом: навески образцов БАД заливали 96% этиловым спиртом и встряхивали в течение 15 мин. Это позволило извлечь производные сибутрамина, содержащиеся в биодобавках в виде субстанций, и свести к минимуму выход соэкстрактивных веществ.

Разработана методика количественного определения ДМС и ДДМС методом ГЖХ с пламенно-ионизационной детекцией и использованием в качестве внутреннего стандарта метилстеарата. Методика обладает необходимой специфичностью, линейностью, правильностью и хорошей воспроизводимостью, что свидетельствует о возможности ее применения для количественного определения производных сибутрамина в БАД к пище в аналитических лабораториях.

Конфликт интересов отсутствует.