Миртазапин - современный тетрациклический антидепрессант группы пиперазин-азепиновых производных, который по фармакологическому действию относится к ряду норадренергических и специфических серотонинергических антидепрессантов [1]. Клинико-фармакологический спектр действия миртазапина характеризуется наличием выраженных тимоаналептического и анксиолитического эффектов, седативным действием и нормализацией сна [2]. В результате передозировки миртазапина с целью суицида наблюдаются разнообразные токсические эффекты [3]. Зафиксированы смертельные отравления миртазапином после применения данного антидепрессанта в монотерапии или в комбинации с другими препаратами: трамадолом, венлафаксином, сертралином, амитриптилином, эсциталопрамом [4, 5]. Разработка эффективных методик изолирования миртазапина из биологического материала, экспрессных и надежных методик его идентификации и количественного определения является актуальной задачей современного судебно-химического анализа.
Из доступных литературных источников известно, что для количественного определения миртазапина в крови и моче описаны методики газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрией [6], высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детекцией и масс-спектрометрией [7, 8], капиллярного электрофореза [9], УФ-спектрофотометрии [10]. К сожалению, не разработаны оптимальные условия изолирования миртазапина из органов и тканей.
Цель исследования - разработка эффективных методик изолирования миртазапина из биологического материала, условий идентификации и количественного определения изолированного миртазапина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с детектированием по УФ-спектру и масс-спектрометрии.
Материал и методы
Использовали печень трупов людей, погибших от травм, а также донорские кровь и мочу. В биологические образцы вводили различные количества водного раствора миртазапина. Пробы оставляли на 24 ч при температуре 36-37 °С. Параллельно проводили контрольные опыты. Из стандартного образца миртазапина («Sigma», США) готовили водный раствор препарата, в 1 мл которого содержалось 100 мкг миртазапина.
Идентификацию и количественное определение миртазапина в исследуемых пробах проводили методом ВЭЖХ. Использовали хроматограф Agilent 1100, оснащенный диодной матрицей с масс-селективным детектором Agilent LC/MSD SL, на колонке Zorbax SB-C18 (1,8 мкм, 4,6×15 мм). Подвижной фазой служила смесь ацетонитрила - 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (95:5). Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Детекцию сигнала проводили при длине волны 254 нм. Объем вводимой пробы 1 мкл. Хроматографирование производили в изократическом режиме.
Идентификацию миртазапина в пробах проводили по времени удерживания с детектированием по УФ-спектру и масс-спектрометрии. Количество миртазапина определяли методом абсолютной калибровки.
Для построения градуировочного графика и расчета уравнения прямой готовили серию растворов миртазапина в этаноле с концентрацией 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 и 20,0 мкг/мл путем разбавления стандартного раствора миртазапина этанолом. На основании полученных результатов рассчитывали уравнение прямой, которое при данных условиях анализа характеризировалось зависимостью: Y=3,25×104Х – 6,27×103, где Y - площадь пика, Х - концентрация миртазапина (мкг/мл); коэффициент корреляции 0,9997. Пользуясь уравнением прямой, рассчитывали содержание миртазапина в пробах, полученных при изолировании препарата из образцов биологического материала.
Результаты и обсуждение
При проверке надежности разработанной методики количественного определения миртазапина в растворах готовили серию этанольных растворов миртазапина с различным содержанием препарата (от 1 до 20 мкг/мл). Эти растворы анализировали методом ВЭЖХ. Количественное содержание миртазапина в растворах рассчитывали по уравнению прямой (табл. 1).
Данную методику использовали для идентификации и количественного определения миртазапина, выделенного из биологического материала. Для изолирования миртазапина из биологических проб использовали следующие методики.
Выделение миртазапина из печени. В химические стаканы вносили по 20 г измельченной печени, а в каждую пробу - по 100, 200, 300, 400 и 500 мкг миртазапина в виде водного раствора (1 мг/мл). Образцы биологического материала инкубировали при температуре 37 °С в термостате. Через 24 ч в каждую порцию биологического материала вносили ацетонитрил (до полного покрытия твердых частиц), подкисляли 1М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,0 и настаивали в течение 30 мин при перемешивании. Настаивание с подкисленным ацетонитрилом проводили дважды. Вытяжки процеживали и разводили дистиллированной водой, объем которой в 3 раза превышал объем ацетонитрильной вытяжки. В каждую пробу вносили 25% раствор аммиака до рН 7,0-8,0 и 3 раза экстрагировали хлороформом порциями по 10, 10 и 5 мл. Хлороформные экстракты объединяли, выпаривали до сухого остатка и растворяли в 5 мл 96% этанола.
Выделение миртазапина из мочи. В ряд химических стаканов вносили по 20 мл мочи, а в каждую порцию биологической жидкости - по 50, 100, 150, 200 и 250 мкг миртазапина в виде водного раствора (1 мг/мл). Через 24 ч в каждую пробу добавляли 25% раствор аммиака до рН 7,0-8,0 и 3 раза экстрагировали хлороформом порциями по 10, 10 и 5 мл. Хлороформные экстракты объединяли, выпаривали досуха и растворяли в 5 мл 96% этанола.
Выделение миртазапина из крови. В ряд химических стаканов вносили по 20 мл крови, а в каждую порцию биологической жидкости - по 50, 100, 150, 200 и 250 мкг миртазапина в виде водного раствора (1 мг/мл). Пробы инкубировали при температуре 37 °С. Затем проводили изолирование миртазапина следующим образом: в каждую пробу крови вносили по 10 мл дистиллированной воды, пробы подкисляли 1М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,0 и вносили по 20 мл ацетонитрила. Смеси перемешивали и оставляли на 30 мин. Затем биологические образцы центрифугировали (15 мин при 5000 об/мин), осадок в центрифужном стакане повторно обрабатывали ацетонитрилом (10 мин), подкисляя пробу 1М раствором хлористоводородной кислоты. Образцы повторно центрифугировали, объединяли и доводили до рН 7,0-8,0, добавляя 25% раствор аммиака. После этого проводили трехкратную экстракцию миртазапина хлороформом порциями по 5 мл. Хлороформные экстракты объединяли, выпаривали досуха и растворяли в 5 мл 96% этанола.
Характер хроматограммы и масс-спектр миртазапина, выделенного из печени, приведены на рисунке.
В пробах, полученных после растворения сухих остатков при изолировании миртазапина из образцов биологического материала, определяли содержание исследуемого препарата методом ВЭЖХ, пользуясь уравнением прямой. Результаты количественного определения миртазапина, выделенного из печени, крови и мочи, приведены в табл. 2.
При проведении идентификации установили, что время удерживания миртазапина, выделенного из печени, составляет 2,88±0,08 мин. Для идентификации миртазапина по масс-спектрам целесообразно использовать сигналы с соотношением m/z 195, 167, 111, 221 и 265.
В пределах концентраций 1-20 мкг/мл относительная ошибка количественного определения миртазапина в растворах методом ВЭЖХ составляет 0,58%.
Установлено, что из мочи при рН 7,0-8,0 изолируется 90,22±1,88% миртазапина. Из печени с помощью ацетонитрила можно изолировать 46,44±1,89% миртазапина, а из крови 50,4±1,05%.
Выводы
1. Разработаны условия идентификации миртазапина в вытяжках из биологического материала методом ВЭЖХ. Абсолютное время удерживания миртазапина на колонке Zorbax SB-C18 составляет 2,88±0,08 мин. В качестве подвижной фазы рекомендуется использовать смесь ацетонитрила с 0,1% раствором трифторуксусной кислоты (95:5).
2. В пределах концентраций миртазапина 1-20 мкг/мл уравнение прямой характеризируется зависимостью: Y=3,25×104Х – 6,27×103 (r=0,9997). Идентичность миртазапина по масс-спектрам подтверждается сигналами с соотношением m/z 195, 167, 111, 221 и 265.
3. Ацетонитрилом, подкисленным 1М раствором хлористоводородной кислоты, из печени можно изолировать 46,44±1,89% миртазапина, а из крови - 50,4±1,05%. При экстракции миртазапина из мочи хлороформом при рН 7,0-8,0 можно изолировать 90,22±1,88% миртазапина.