Диагностические возможности методов иммуногистохимии при гистологическом исследовании сердца

Гистологическое исследование сердца в судебно-медицинской практике является одним из наиболее важных при его повреждениях, причиняемых тупыми и острыми предметами [1], а также приобретает первостепенное значение в диагностике внезапной сердечной смерти [2—4]. В этих случаях у экспертов нередко возникают затруднения в определении достоверности спазма мелких артерий, характеристике популяций различных клеток, а также в определении давности реактивных изменений в миокарде в ответ на причиненное повреждение.

Рекомендованные приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ №346н от 12.05.2010 обзорные методы окраски (гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, Маллори) часто не позволяют четко дифференцировать на препаратах различные популяции клеток соединительной ткани, среди которых тучные клетки имеют наиболее важное значение. Расширить диагностические возможности гистологического исследования позволяет использование методов иммуногистохимии, которые постепенно внедряются в судебно-медицинскую практику как за рубежом [5, 6], так и в России [7, 8]. Однако в связи с обилием иммуногистохимических маркеров и сложностью адаптации новых методов для судебно-гистологического материала сохраняются определенные затруднения при подборе наиболее эффективных и информативных маркеров.

Цель настоящего исследования — подбор иммуногистохимических маркеров, позволяющих расширить диагностические возможности гистологического исследования сердца, и разработке протоколов иммуногистохимических реакций, выполняемых в условиях гистологического отделения бюро судебно-медицинской экспертизы (СМЭ).

Материалом для исследования служили фрагменты миокарда левого желудочка людей, погибших от различных причин (n=15). В настоящем исследовании использован архивный материал СПб ГБУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы», взятый в рамках плановой аутопсии для гистологического исследования, фиксированный в 10% растворе формальдегида, обезвоженный с использованием тканевого процессора Leica TP 1020 и залитый в парафин стандартным образом. Срезы толщиной 7 мкм изготавливали на ротационном микротоме PFM Rotary 2003 (PFM, Германия). Использовали предметные стекла Menzel (Германия) с адгезивным покрытием на основе бычьего сывороточного альбумина [9] и предметные стекла, покрытые полилизином (polysine, «Menzel», Германия). С использованием иммуногистохимических маркеров (антител) выявляли тучные клетки, миофибриллы кардиомиоцитов, гладкие миоциты в составе стенок кровеносных сосудов, макрофаги, эндотелиоциты сосудов и нервные волокна (табл. 1).

В каждом случае проводили подбор оптимальных условий обработки различными реагентами, определяли необходимость проведения дополнительных этапов обработки (различных блокировок и теплового демаскирования антигенов) и осуществляли подбор наиболее эффективных систем визуализации продуктов иммуногистохимической реакции.

Для визуализации связавшихся первичных антител были использованы наборы реагентов Reveal Polyvalent HPR DAB Detection System («Spring Bioscience», США), Super Sensitive Polymer-HRP Detection System («BioGenex», США), EnVision+ («Dako», Дания) и диаминобензидиновый хромоген из набора DAB+ («Dako», Дания). Тепловое демаскирование антигенов проводили в пароварке (TEFAL, Франция) в сосуде Хелендахела с модифицированным цитратным буфером pH 6,1 («Dako», Дания; номер по каталогу S1700). После постановки иммуногистохимических реакций проводили подкраску части срезов, подбирая ее таким образом, чтобы обеспечить лучшую ориентацию в микроструктурах препарата и при этом не ухудшить определяемость результатов иммуногистохимической реакции. Из проверенных способов подкраски наилучшие результаты дало использование гематоксилина и астрового синего. Более подробно все этапы и условия проведения иммуногистохимических реакций приведены в табл. 2.

В результате обработки препаратов, согласно предложенным протоколам, удалось четко и селективно выявить все тканевые элементы, перечисленные в табл. 1(см. рисунок, на цв. вклейке).

Наиболее четкие и информативные препараты были получены при использовании антител к триптазе, селективно выявляющих тучные клетки и позволяющих регистрировать их дегрануляцию, а также антител к α-актину, окрашивающих гладкие миоциты стенок мелких артерий и артериол, что дает возможность достоверно судить о наличии (либо отсутствии) их спазма. Благодаря реакции на нейроспецифичный белок PGP9.5 удалось определить деструктивные изменения в нервных стволах, проходящих в миокарде, а также выявить исчезновение нервных элементов в участках миокарда — признаков, характерных для возрастной инволюции периферической нервной системы и внезапной сердечной смерти [2].

Таким образом, проведенным исследованием было установлено, что стандартная обработка гистологического материала, проводимая в оснащенном современными техническими средствами гистологическом отделении бюро СМЭ, позволяет успешно использовать ряд селективных иммуногистохимических методов, расширяющих диагностические возможности судебно-гистологического исследования в решении вопросов наступления внезапной (сердечной) смерти.