Современная тенденция к миниатюризации показала, что вещество может иметь совершенно новые свойства, если взять очень маленькую частицу этого вещества. Частицы размером от 1 до 100 нм обычно называют наночастицами.

К биологическим нанообъектам относятся молекулы белков, нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) и полисахаридов, формирующие внутриклеточный каркас (цитоскелет) и внеклеточный матрикс, мембранные каналы, рецепторы и переносчики, систему внутриклеточной сигнализации, молекулярные аппараты для синтеза, упаковки и утилизации белков и нуклеиновых кислот, производства энергии, внутриклеточного транспорта и движения клеток. Размер белковых молекул и надмолекулярных белковых комплексов колеблется от 1 до 1000 нм. Диаметр спирали ДНК составляет 2 нм, а ее длина может достигать нескольких сантиметров. Белковые комплексы, формирующие нити цитоскелета, имеют толщину 7—25 нм при длине до нескольких микрон. Белковые комплексы, образующие поры, достигают 120 нм в диаметре. Внеклеточные структуры также могут иметь наноразмерные характеристики. Так, экзосомы — везикулы, переносящие материал между клетками, имеют диаметр 65—100 нм, а частицы липопротеинов плазмы крови, транспортирующие липиды в организме, — 17—50 нм. К наноразмерным формам существования живой материи относятся вирусы, прионы. Их размеры находятся в диапазоне 25—300 нм.

Как следует из сказанного, биологические системы состоят из наноразмерных строительных блоков и «молекулярных машин» (комплексов специализированных белков). Их организация и принципы работы открывают широчайшие возможности для разработки новых подходов в биологических и медицинских исследованиях. Вместе с тем высокоточные методы исследований обеспечивают биологические науки инструментарием и технологиями для изучения организации живого на молекулярном уровне.

Высокая скорость развития структурных сдвигов, которые на уровне наноструктур колеблются в амплитудном диапазоне молекулярных группировок, предполагает применение прецизионных исследовательских нанотехнологий, позволяющих с высоким пространственным разрешением визуализировать эти эффекты. Для этих целей достаточно подходящими являются методы сканирующей зондовой микроскопии, которые обладают приемлемой разрешающей способностью (сканирующие электронные микроскопы — SEM до 10 нм, атомно-силовые — АСМ до 2 нм), а также возможностью исследовать образцы с минимальной пробоподготовкой (без применения химических фиксаторов). С помощью SEM, используя технологию рентгенэнергодисперсионного анализа (EDAX), можно определить содержание химических элементов, а при атомно-силовой микроскопии (АСМ) провести локальную адгезиометрию четко позиционированных структур.

Сканирующая зондовая микроскопия — один из мощных современных методов исследования морфологических и локальных свойств поверхности твердого тела с высоким пространственным разрешением.

Первый из семейства зондовых микроскопов — сканирующий туннельный микроскоп — был изобретен в 1981 г. швейцарскими учеными Гердом Биннигом и Генрихом Рорером. После визуализации атомарной структуры поверхности ряда материалов и, в частности, реконструированной поверхности кремния [1—3] данная методика получила настоящее признание. В 1986 г. за создание туннельного микроскопа Г. Биннигу и Г. Рореру была присуждена Нобелевская премия по физике. Вслед за туннельным микроскопом в течение короткого времени были созданы АСМ, магнитно-силовой, электросиловой, ближнепольный оптический микроскоп и многие другие приборы, имеющие сходные принципы работы и называемые сканирующими зондовыми микроскопами (СЗМ). Принцип метода заключается в том, что тонкий зонд-игла (кантилевер) перемещается в сканирующем режиме над поверхностью образца и при этом регистрируются некоторые взаимодействия (в основном ван-дер-ваальсовы и контактные) между поверхностью и зондом. Основываясь на магнитных, электропроводных, температурных, топографических и других свойствах исследуемого материала, можно определить различные виды таких взаимодействий [1, 2, 4, 5].

В настоящий момент в большинстве исследовательских лабораторий сканирующая зондовая и электронная микроскопия используются как дополняющие друг друга методы исследования в силу ряда физических и технических особенностей. В сравнении с растровым электронным микроскопом (РЭМ) СЗМ обладает рядом преимуществ. Так, в отличие от РЭМ, который дает псевдотрехмерное изображение поверхности образца, СЗМ позволяет получить истинно трехмерный рельеф поверхности. Кроме того, СЗМ позволяет получать изображение как проводящей, так и непроводящей поверхности, тогда как для изучения непроводящих объектов с помощью РЭМ необходимо металлизировать поверхность. Для работы с РЭМ необходим вакуум, в то время как большая часть режимов СЗМ предназначена для исследований на воздухе, в вакууме и в жидкости. Благодаря этому с помощью СЗМ можно изучать материалы и биологические объекты в нормальных для этих объектов условиях, например биомакромолекулы и их взаимодействие, живые клетки.

В принципе СЗМ способен дать более высокое разрешение, чем РЭМ. Так, было показано, что СЗМ в состоянии обеспечить реальное атомное разрешение в условиях сверхвысокого вакуума при отсутствии вибраций. Сверхвысоковакуумный СЗМ по разрешению сравним с просвечивающим электронным микроскопом.

Подготовка образцов для СЗМ занимает меньше времени, чем для РЭМ. Обычный СЗМ не в состоянии сканировать поверхность так же быстро, как РЭМ. Для получения АСМ-изображения, как правило, требуется несколько минут, в то время как РЭМ после откачки способен работать практически в реальном масштабе времени, хотя качество работы относительно невысокое. Для увеличения быстродействия АСМ было предложено несколько конструкций, среди которых можно выделить зондовый микроскоп, названный Видео-АСМ. Видео-АСМ обеспечивает получение изображений поверхности удовлетворительного качества с частотой телевизионной развертки, что даже быстрее, чем на обычном РЭМ. Однако применение Видео-АСМ ограничено, так как работает он только в контактном режиме и на образцах с относительно небольшим перепадом высот.

К недостатку СЗМ при его сравнении с РЭМ следует отнести небольшой размер поля сканирования. РЭМ в состоянии просканировать область поверхности размером в несколько миллиметров в латеральной плоскости с перепадом высот в несколько миллиметров в вертикальной плоскости. У СЗМ максимальный перепад высот составляет несколько микрометров, как правило, не более 25 мкм, а максимальное поле сканирования в лучшем случае порядка 150×150 мкм. Другая проблема заключается в том, что качество изображения определяется радиусом кривизны кончика зонда, что при неправильном выборе зонда или его повреждении приводит к появлению артефактов на получаемом изображении [6]. СЗМ-изображения могут также быть искажены гистерезисом пьезокерамического материала сканера и перекрестными «паразитными» (нежелательными, тремин) связями, действующими между X-, Y-, Z-элементами сканера. Для исправления искажений в реальном масштабе времени в современных СЗМ используется программное обеспечение (например, ориентированное сканирование), либо сканеры, снабженные замкнутыми следящими системами, в состав которых входят линейные датчики положения. В других СЗМ вместо сканера в виде пьезотрубки используются X-, Y- и Z-элементы, механически не связанные друг с другом, что позволяет исключить часть «паразитных» связей. Однако в некоторых случаях, например при совмещении с электронным микроскопом и ультрамикротомами, конструктивно оправданно использование именно сканеров на пьезотрубках [1].

Сегодня методы сканирующей зондовой микроскопии, в частности, АСМ, активно используются в ключевых областях исследований. Несмотря на то что АСМ появилась сравнительно недавно, на данном этапе ее развития разработан спектр методик измерения поверхности и локальных свойств различных материалов. В зависимости от задачи и типа образца подбирается определенная методика измерения, которая позволяет достигнуть необходимого разрешения и уменьшить вероятность повреждения зонда и объекта исследования.

Повышение сложности научных экспериментов, необходимость минимизации времени, а также переход от частных к комплексным автоматизированным решениям, учитывающим специфические особенности конкретной задачи, приводят к увеличению количества и сложности проектов по автоматизации измерений. При разработке сложных решений необходимо уменьшить зависимость результатов от таких факторов, как теоретическая подготовка исследователя, опыт работы на приборе и затраченное время. Таким образом, создание научно обоснованных технологических методов автоматизации АСМ-измерений является актуальной научно-технической проблемой.

Сегодня АСМ — бурно развивающаяся область техники и прикладных научных исследований в таких областях, как материаловедение, нанообработка, решение задач, связанных с изучением полупроводников, порошков и тонких пленок и множество других.

В настоящее время одним из стремительно развивающихся направлений в области прецизионных исследований являются биология и медицина. Анализ доступной литературы позволяет разделить работы в этом направлении на несколько значимых групп: физико-математические исследования, направленные на решение задач по развитию, автоматизации и усовершенствованию методик сканирования биологических объектов [7, 8]; фундаментальные биологические исследования, позволяющие с помощью СЗМ получить новые знания об изучаемых объектах [9—13]; биомедицинские и медицинские исследования, в которых методы сканирующей зондовой микроскопии используются для регистрации изменений изучаемых объектов при различных заболеваниях и патологических процессах [14—20]. В отдельную группу можно выделить разработки по усовершенствованию методик пробоподготовки в зависимости от характера сканируемого биологического образца и целей исследования [21—26].

На сегодняшний день отечественными и зарубежными исследователями успешно решаются проблемы изучения различных биологических тканей [27], клеточных структур [16, 23], мембран клеток [14, 16], бактерий [9], белков [5], вирусов и ДНК [4], а также взаимодействия этих объектов с другими [28].

Применение в биологии методов АСМ представляет собой сложную задачу прежде всего потому, что в случаях, когда зонд находится в контакте с поверхностью, относительно большая сила взаимодействия может привести к необратимой деформации объекта исследования и зонда (особенно важно при использовании острых зондов, дающих высокое разрешение). Кроме того, обычно объект слабо зафиксирован на подложке или требует наличия жидкой среды [26]. В большинстве случаев такие измерения требуют специфических навыков работы и больших затрат времени при проведении исследований. Выбор методики измерения, анализ режимов работы, настройка параметров сканирования — это и многое другое может существенно влиять на истинность полученных результатов, пространственное разрешение и сохранность объекта исследования [21—23, 25, 26]. В связи с этим автоматизированные методы АСМ, касающиеся измерения биологических объектов, очень востребованы.

Применение методов сканирующей зондовой микроскопии предоставляет уникальную возможность исследовать биологические объекты, не используя сложные методы фиксации. Однако способы подготовки образцов для исследования, безусловно, оказывают влияние на морфологические характеристики клетки. Опыт исследования эритроцитов является прекрасной иллюстрацией значимости выбора способа подготовки клетки к АСМ-исследованию. За последние несколько лет изучены нефиксированные эритроциты [29], клетки, фиксированные на воздухе [9] и находящиеся в физиологическом растворе [30].

В доступных литературных источниках приводятся различные данные о выборе фиксатора, его концентрации, длительности фиксации и методике подготовки образцов для АСМ-сканирования эритроцитов.

Следует отметить, что эритроциты являются очень «деликатными» (мягкими) клетками, что весьма затрудняет их АСМ-изучение в растворе. Высокая нестабильность формы эритроцитов, исследуемых в физиологических условиях, является причиной «размытых» АСМ-изображений, а максимальное разрешение в этом случае не превышает 200 нм [31].

Высушивание, замораживание или фиксация химическими агентами значительно улучшает качество АСМ-изображений эритроцитов и воспроизводимость результатов сканирования мембранной поверхности. Однако эти процедуры сказываются на структурных и механических свойствах клеток [21].

Сравнительную оценку морфофункциональных характеристик нативных и фиксированных эритроцитов провели F. Liu и соавт. [22], использовав несколько режимов исследования и пробоподготовки. Авторами выполнено сканирование нативных клеток во влажной камере; сканирование на воздухе клеток, фиксированных метанолом; сканирование клеток, фиксированных метанолом в жидкостной ячейке; сканирование высушенных нефиксированных клеток на воздухе. Выявлено достоверное изменение модуля упругости эритроцитов при высушивании мазков на воздухе и фиксации метанолом, имеющее взаимосвязь с изменением их геометрических параметров. При сканировании в жидкостной ячейке отмечено низкое разрешение получаемых изображений. Высушивание клеток на воздухе инициирует их «распластывание» на подложке со снижением высоты [22].

Сравнив различные методы подготовки эритроцитов, M. Takeuchi и соавт. [21] делают заключение, что высушивание образцов на воздухе после предварительной фиксации в глутаровом альдегиде значительно искажает результаты АСМ-сканирования. В то же время именно после фиксации расширяются возможности выявления таких внутриклеточных элементов, как цитоскелет [10, 27]. Более того, высокое разрешение для АСМ-изображений (порядка 10 нм) может быть получено только на воздухе.

N. Kubo и соавт. [14] для подготовки образцов отмывали эритроциты в физиологическом растворе с последующей фиксацией в 3% формальдегиде в течение 5 мин.

X.-L. Ji и соавт. [23] провели сравнение различных способов фиксации мазков крови наиболее часто применяемыми в лабораториях реактивами, в том числе 1 и 5% растворами формальдегида, 3% раствором глутарового альдегида, изотоническим раствором хлорида натрия, 5% раствором декстрозы. Оценив структуру поверхностей мембран, количество артефактов и выраженность деформации клеток, исследователи выносят заключение о пригодности указанных растворов для подготовки образцов для АСМ-исследований.

U. Hofmann и соавт. [10] для проведения АСМ-исследований подвергали эритроциты химической фиксации с помощью 1% глутарового альдегида, длительность фиксации авторами не указана. Далее эритроциты отмывали 1 раз в буферном растворе, затем дважды в дистиллированной воде, после чего помещали на предметное стекло и высушивали.

O. Hekele и соавт. [16] использовали глутаровый альдегид той же концентрации, однако методика подготовки образцов отличалась. Мазок крови наносился на стекло, после чего фиксировался в глутаровом альдегиде с последующим промыванием в растворе фосфатного буфера и повторной фиксацией в глутаровом альдегиде в течение 1 мин.

S. Sen и соавт. [7] для своих исследований перед изготовлением мазков крови обрабатывали подложки поли-L-лизином, а эритроциты предварительно отмывали в 1% растворе фосфатного буфера.

Для оценки структурных особенностей мембраны эритроцита (наноканалов, эрозий мембраны) наиболее приемлемым способом пробоподготовки является фиксация мазка крови высушиванием на воздухе [10, 27, 32, 33].

Система крови — одна из важнейших гомеостатических систем организма. Возникающие в ней патологические процессы могут быть как проявлениями критических и терминальных состояний, так и причинами развития последних. Именно поэтому клетки крови, и в первую очередь эритроциты, являются постоянным объектом для биологических и медицинских исследований.

В научной литературе широко представлены различные способы исследования формы и размеров эритроцитов с использованием методов световой и электронной микроскопии. Внедрение в практику методов сканирующей зондовой микроскопии позволяет получать новые сведения об особенностях строения поверхности мембраны клетки, оценивать химический состав мембраны и ее адгезионные свойства. Преимуществом АСМ можно считать получение информации о микро- и наноархитектонике поверхности клетки, а также структур подмембранных слоев, включая цитоскелет [5, 12, 16, 21, 34].

В отечественной и зарубежной литературе имеется ряд сообщений об исследовании эритроцитов человека и животных методами сканирующей зондовой микроскопии при различных физиологических и патологических состояниях.

N. Kubo и соавт. [14] исследовали эритроциты больных аутоиммунной гемолитической анемией с целью визуализации антиэритроцитарных аутоантител на поверхности мембран эритроцитов. Полученные сканы позволили визуализировать белки класса IgG в виде возвышающихся над поверхностью мембраны образований диаметром до 40 нм. В своем сообщении японские исследователи отмечают перспективность изучения мембран эритроцитов методом АСМ для лучшего понимания природы аутоиммунных заболеваний.

А. Ebner и соавт. [19] изучили структурные и механические параметры эритроцитов больных муковисцидозом и системной красной волчанкой. АСМ позволила выявить изменения поверхности мембран клеток и структурную перестройку их цитоскелета с образованием зон локального уплотнения.

O. Hekele и соавт. [16] провели АСМ-исследование эритроцитов для определения структуры и эластических свойств мембран клеток у больных хронической почечной недостаточностью с анемией на фоне приема эритропоэтина, при этом достоверных различий с эритроцитами здоровых доноров выявлено не было. При этом у одного из обследованных контрольной группы было выявлено значимое упрочнение мембран эритроцитов и снижение их эластичности, при более детальном клиническом обследовании у него была выявлена латентная форма сахарного диабета.

Патологическим изменениям структуры мембран эритроцитов при сахарном диабете посвящен ряд отдельных исследований. Методом АСМ у больных с гипергликемией определены особенности рельефа поверхности мембран эритроцитов, выявлено увеличение их жесткости. Указанные изменения структуры клеток при сахарном диабете определяют изменения реологических свойств крови и имеют четкую корреляционную связь с выраженностью расстройства микроциркуляции [17, 18].

Y. Zhang и соавт. [20] использовали АСМ для изучения изменений в крови при железодефицитной анемии. Сканы эритроцитов этих больных до и после лечения использовали для измерения макропараметров клеток и анализа структур поверхности мембран. В процессе лечения эритроциты с большой вариабельностью меняли не только форму и размеры, но и структуру поверхности мембран. Авторы предлагают шире использовать метод АСМ для ранней диагностики и оценки терапевтического эффекта лечения в гематологической практике.

Подобного мнения придерживаются D. Chicea и соавт. [5], изучавшие форму и структуру мембран сфероцитов крови больных аутоиммунной гемолитической анемией. Исследователи указывают на ограниченные возможности оптической микроскопии для объективной оценки выраженности сфероцитоза и подчеркивают высокую информативность АСМ-сканов в режиме 3D.

Для судебно-медицинских экспертов наибольший интерес представляют единичные публикации, демонстрирующие эффективность АСМ как аналитического инструмента, применимого в судебно-медицинской науке.

Определению давности смерти одной из актуальных проблем судебной медицины посвящена работа китайских исследователей Y. Chen и J. Cai [32], в которой высказывается идея изучения эритроцитов в пятнах крови с места преступления методом АСМ. Описана динамика деформации эритроцитов и изменения ультраструктуры их мембран в течение 5 дней. На 3-и сутки контакта крови с воздухом отмечено появление нанометровых выступов, размеры и количество которых достоверно увеличиваются с течением времени. Авторы рассматривают АСМ как перспективный прецизионный метод для установления времени смерти.

С целью оценки «возраста» пятна крови метод АСМ также применили S. Strasser и соавт. [33]. Изучая в динамике в течение 4 нед нефиксированные высушенные на воздухе на стеклянных подложках мазки крови, авторы выявили снижение эластичности мембран эритроцитов с течением времени. Исследователи обсуждают возможность создания калибровочных кривых показателей эластичности мембраны клетки с учетом температуры и влажности среды для решения задач практической судебно-медицинской экспертизы.

Приведенные в сообщении данные, разумеется, не претендуют на полный охват сведений о разноцелевом применении методов сканирующей зондовой микроскопии. В то же время авторы выражают твердую уверенность в том, что и эти, и иные методы прецизионных исследований в недалеком будущем займут достойное место в повседневной судебно-медицинской практике при решении самых разных экспертных задач.