Несмотря на огромное количество работ, посвященных проблеме кариеса зубов, это заболевание по-прежнему широко распространено в популяции. Очевидно, что этиологическим фактором, инициирующим кариес, несомненно, остается микрофлора, вегетирующая в составе мягкого зубного налета [1, 2]. При этом отмечено, что кариозные полости могут возникать и при адекватной гигиене полости рта. Исследователи склонны объяснять это особенностями физико-химического и морфологического строения зубных тканей, количественным и качественным соотношением в них апатитов, микроэлементным составом и т.д. Эти факторы в своей совокупности способствуют формированию различной степени устойчивости твердых тканей зубов к процессам деминерализации [3, 4]. Речь идет о локальной тканевой реакции самого субстрата воздействия микрофлоры — зубной эмали, обеспечивающейся ее свойствами и строением.

Инициатором процесса кальцификации эмали, обеспечивающим впоследствии ее кристаллическую организацию, является белковая матрица [5—7]. Последняя связана с кристаллами гидроксиапатита — на сформированной белковой матрице возникают ядра кристаллизации [8—10]. Таким образом, белковые матрицы регулируют и упорядочивают процесс минерализации зубной эмали. Нарушение этого процесса происходит при подавлении синтеза белковых матриц.

Калликреин-4 является основным ферментом стадии созревания и отвечает за замещение белковой матрицы на минералы и формирование правильной организации кристаллов. Пептидаза калликреина-4 является своего рода эвакуатором остаточных фрагментов матричных белков при замене их на минералы, регулирует обработку органической матрицы эмали, что определяет структуру и состав эмали [11—13]. Полиморфизмы гена калликреина-4 определяют формирование высокого или низкого индекса кристалличности, регулирующего амелогенез.

Индекс кристалличности — интегральная величина, характеризующая тип строения кристалла. Индекс кристалличности участвует в формировании своеобразной «упаковки» этих кристаллов, формируя определенную пористость и текстуру зубной эмали, что обеспечивает ее устойчивость к процессам деминерализации. В зависимости от мутаций гена каллекреина-4 эмаль должна характеризоваться определенным индексом кристалличности, который обеспечивает специфическую текстуру эмали.

Цель исследования — обосновать перспективность индекса кристалличности зубной эмали в качестве критерия индивидуального потенциального риска развития кариеса зубов.

Материал и методы

Кристаллографические особенности зубной эмали изучены с помощью методов просвечивающей электронной микроскопии при помощи аппарата JEM-2100 «JEOL» (ускоряющее напряжение 200 кВ, разрешение по кристаллической решетке 0,14 нм) и инфракрасной спектроскопии посредством аппарата Nicolet- 5700 «Thermo Electron Corp.» (количество накопления спектров 30 см^–1, разрешение 4 см^–1) [14, 15].

Определение белка в зубной эмали проводили по методу Барнштейна [16]. Исследованию были подвергнуты 120 образцов эмали интактных премоляров верхних челюстей, удаленных по ортодонтическим показаниям у лиц в возрасте 18—35 лет, проживающих в Омске. Непосредственно перед проведением исследования выделяли чистый препарат эмали (коронковую и корневую части зуба разделяли с помощью алмазного бора, эмаль механически освобождали от подлежащих тканей — дентина и пульпы).

Предварительно лица, у которых удалялись зубы, были генотипированы по полиморфизмам G/G, G/A и A/A гена калликреина-4 в мутационных точках G2664153A и G2142A. Материалом для молекулярно-генетического исследования служила венозная кровь пациентов.

Кроме того, у данных пациентов были изучены некоторые параметры ротовой жидкости как среды, окружающей зубы [16]. В надосадочной части ротовой жидкости измеряли содержание кальция, фосфора. Потенциометрически определяли pH, Ca²⁺ с использованием ионоселективных электродов на pH-метре ОП2/208/01 и потенциометре ЭВ-74. Произведение растворимости гидроксиапатита (минерализующий потенциал) в надосадочной жидкости высчитывали по формуле: ACa²⁺· ANPO₄^2–. Степень перенасыщенности слюны гидроксиапатитом определялась отношением расчетного произведения растворимости гидроксиапатита к стандартному. За стандартное произведение растворимости гидроксиапатита принята величина 1,2·10^–7. Определение белка в ротовой жидкости проводили с использованием биуретовой реакции.

Результаты и обсуждение

Установлено, что исследованные образцы зубной эмали представлены агрегатами различных геометрических форм размерами от 20 до 200 нм, состоящими из первичных кристаллитов (рис. 1).

Рис. 1. Электронно-микроскопическая фотография образца интактной зубной эмали.

На фотоснимках с высокой степенью разрешения прослеживаются фрагменты с периодичностью 0,272 и 0,226 нм, что соответствует плоскостям (300) и (310) (рис. 2). Наблюдаются отчетливые слои атомной пространственной решетки, а также гексагональные призматические структуры. Спектры в диапазоне 400—700 см^–1 зарегистрированы после усреднения экспериментальных данных. Представленную спектральную область можно отнести к υ₄ PO₄ колебаниям в молекуле гидроксиапатита.

Рис. 2. Электронно-микроскопическая фотография высокого разрешения кристаллического участка гидроксиапатита образца эмали.

На дифрактограммах, полученных с помощью метода преобразования Фурье (Fast Fourier Transform — FFT), электронно-микроскопические изображения наблюдаемых кристаллитов имеют вид точечных рефлексов. Это свидетельствует в пользу высокой степени упорядоченности структуры кристаллических слоев, что подтверждает высокую степень кристалличности гидроксиапатита в изучаемых образцах эмали и позволяет рассчитать межплоскостные расстояния в кристаллах гидроксиапатита (рис. 3).

Рис. 3. Снимки дифракции, полученные с различных участков кристаллов гидроксиапатита в образцах интактной эмали, свидетельствующие о высокой степени упорядоченности структуры кристаллических слоев.

Согласно данным, полученным с помощью метода FFT, межплоскостные расстояния имеют следующие значения: 0,277±0,003, 0,272±0,003, 0,226±0,003 и 0,39±0,003 нм. Эти значения соответствуют структуре с химической формулой Ca₅(PO₄)₃OH (карточка PDF №09-0432), которая характерна для синтетического гидроксиапатита с удвоенной брутто-формулой Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂. Отмечаются четко выраженные, многократно повторяющиеся рефлексы анализируемых дифрактограмм. Анализ полученных изображений позволяет сделать вывод о высокой степени когерентности кристаллической структуры исследуемых частиц гидроксиапатита в представленных образцах зубной эмали и соответствующей структуры синтетического гидроксиапатита.

Индекс кристалличности зубной эмали отражает пространственную ориентацию кристаллитов и отчасти дефектность кристаллических слоев. Рассчитав индекс кристалличности, можно сравнивать степень упорядоченности структуры и относительного размера кристаллитов в исследуемых образцах эмали зубов, тем самым выявляя их возможные структурные различия. Вычисление индекса кристалличности, полученного методом инфракрасной спектроскопии, определяется как величина A_кр=(A₆₀₂+A₅₆₇)/A₅₈₈. Индекс кристалличности зубной эмали составил 3,54 для 56 (47%) исследуемых образцов и 3,27 для 64 (53%) исследуемых образцов. Таким образом, можно сделать вывод, что относительный размер кристаллитов и степень упорядоченности кристаллической решетки гидроксиапатита для образцов эмали первой исследуемой группы выше, чем для образцов эмали второй группы. Соответственно, дефектность структуры кристаллитов в первом случае, наоборот, ниже. Эти факторы, по нашему мнению, и обусловливают устойчивость к кариесу образцов зубной эмали первой исследуемой группы.

Кристаллическая структура эмали формируется белковой матрицей, которая, связываясь с кристаллами гидроксиапатита, является инициатором кальцификации, образуя «каркас» этой ткани. В ходе проведенного исследования установлено, что в образцах зубной эмали с индексом кристалличности 3,27 массовая доля белка почти в 2 раза выше, чем в образцах с индексом кристалличности 3,54 (p<0,001) (табл. 1). Очевидно, эти показатели обусловливают физико-химические различия в строении зубной эмали, играя важнейшую роль в формировании ее устойчивости к кариесу.

Таблица 1. Массовая доля белка исследуемых образцов интактной зубной эмали

Массовая доля белка в зубной эмали сугубо индивидуальна, поэтому проблему минерализации твердых тканей зубов необходимо рассматривать с молекулярно-генетических позиций. При изучении ассоциаций генотипов и аллелей гена калликреина-4 в мутационных точках G2664153A и G2142A с количеством белка удалось установить почти пятикратное повышение частот генотипов A/A по отношению к генотипам G/G и G/A у лиц, эмаль которых имела индекс кристалличности 3,27, что сопровождается достоверным повышением массовой доли белка (p<0,001).

Кроме того, массовая доля белка в зубной эмали зависит от свойств ротовой жидкости. При этом изменяются процессы минерализации и самоочищения полости рта.

Основные параметры ротовой жидкости обследованных лиц отражены в табл. 2. Следует отметить достоверные различия по ряду изучаемых показателей у лиц сравниваемых групп. Так, у лиц с индексом кристалличности зубной эмали 3,27 выше общая концентрация неорганического фосфора (p≤0,01). При этом общая концентрация кальция достоверно не различается в ротовой жидкости пациентов обеих сравниваемых групп. Это приводит к достоверному снижению кальций-фосфорного мольного коэффициента в группе пациентов с индексом кристалличности 3,27 (p≤0,01). Активная концентрация кальция была наибольшей также у пациентов с индексом кристалличности 3,27 и достоверно отличалась от аналогичного показателя у пациентов с индексом кристалличности 3,54 (p≤0,01). Произведение растворимости гидроксиапатита в ротовой жидкости пациентов с индексом кристалличности 3,27 было достоверно выше, чем в группе пациентов с индексом кристалличности 3,54 (p≤0,05). Такая же зависимость наблюдается и при анализе показателей, характеризующих степень перенасыщенности ротовой жидкости гидроксиапатитом. Наибольшие концентрации белка обнаружены в ротовой жидкости с индексом кристалличности 3,27 (p≤0,01).

Таблица 2. Сравнительная характеристика основных показателей ротовой жидкости обследованных лиц с различным индексом кристалличности зубной эмали

Примечание. Указаны только статистически значимые показатели.

Заключение

Кристаллографические особенности зубной эмали закреплены генетически. Нарушения упорядоченности кристаллов в структуре гидроксиапатита возникают вследствие снижения массовой доли белка в зубной эмали, что обусловлено мутациями гена калликреина-4 в позициях G2664153A и G2142A. Преобладание патологической гомозиготы A/A гена калликреина-4 приводит к формированию индекса кристалличности 3,27, обусловливающему низкую степень резистентности зубной эмали. Наличие нормальной гомозиготы G/G гена калликреина-4 в обеих исследуемых мутационных точках способствует формированию индекса кристалличности 3,54, что обусловливает высокую степень резистентности зубной эмали. При индексе кристалличности 3,27 в ротовой жидкости увеличивается ряд лабораторных показателей: содержание фосфора, активная концентрация кальция, концентрация белка, произведение растворимости гидроксиапатита и степень перенасыщенности гидроксиапатитом, что также влечет нарушения процессов минерализации и, как следствие, реализацию кариеса зубов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.