Введение

Материалы на основе гидроксиапатита (ГА) находят широкое применение в тканевой инженерии костной ткани благодаря их биосовместимости и выраженным остеокондуктивным свойствам [1, 2]. Материалы и скаффолды на основе ГА используют для восполнения костных дефектов [3—5]. Покрытия на основе ГА используют для лучшей остеоинтеграции дентальных имплантатов [6—9].

Наиболее широко используемыми методами получения покрытий из ГА на титановых матриксах являются плазма-спрей и золь-гель [1, 4, 10]. Оба этих метода относительно просты в реализации и позволяют получить достаточно толстое пористое покрытие, составляющее десятки и сотни микрометров. Однако полученные с помощью этих методов покрытия не отличаются высокой адгезией к поверхности имплантатов, что существенно снижает надежность технологии и создает риск развития осложнений в случае отслаивания покрытия.

В настоящей работе объектом исследования является покрытие из ГА, полученное методом высокочастотного магнетронного напыления при низких давлениях в атмосфере инертного газа (далее — ВЧ магнетронное напыление). Этот метод более сложен в осуществлении, чем золь-гель и плазма-спрей, а получаемые с его помощью покрытия обычно не превышают нескольких микрометров по толщине. Однако этот метод имеет ряд характерных преимуществ, подробное описанных в литературе [11, 12]. Основное из них — высокая адгезия нанесенного покрытия к подложке, обусловленная плазменной обработкой материала подложки ионами инертного газа в процессе нанесения покрытия и отсутствием посторонних загрязняющих веществ в силу вакуумной природы этой технологии. Кроме того, метод обеспечивает следующие преимущества. Во-первых, отсутствие разогрева покрытия в процессе напыления. Это предотвращает фазовые превращения ГА и устраняет негативные эффекты из-за различных коэффициентов термического расширения ГА и титана. Во-вторых, контроль состава и стехиометрии. Напыление происходит непосредственно с мишени из ГА в вакууме, что исключает попадание посторонних веществ в состав покрытия и позволяет реализовывать близкое к оптимальному соотношение Ca/P. В-третьих, высокие прочностные характеристики покрытия. Полученные с помощью ВЧ магнетронного распыления пленки отличаются равномерностью нанесения, отсутствием трещин и больших пор. Это делает покрытие более устойчивым в условиях нагрузок, а также замедляет процесс его биодеградации. В-четвертых, высокая масштабируемость процесса нанесения покрытий и высокая воспроизводимость результатов за счет контроля условий в процессе вакуумно-плазменного осаждения.

Цель исследования: изучение цитосовместимости покрытия из гидроксиапатита для титановых имплантатов, нанесенного методом высокочастотного магнетронного напыления при низких давлениях в атмосфере инертного газа.

Материал и методы

Метод высокочастотного магнетронного напыления при низких давлениях в атмосфере инертного газа. Процесс ВЧ магнетронного напыления выполняли в универсальной вакуумной камере объемом 0,7 м³, оснащенной тремя магнетронами. Откачку камеры осуществляли каскадом из форвакуумного и турбомолекулярного насосов. Остаточное давление не превышало 0,01 мТор. Рабочий газ — аргон 99,99% чистоты — подавали в камеру через ротаметр, где проводили контроль его расхода. Давление рабочего газа в процессе ВЧ магнетронного напыления составляло 1,3 мТор. Для напыления использовали магнетрон с диаметром мишени 7 см. К мишени через систему согласования подводили напряжение от ВЧ генератора с частотой 13,56 МГц. ВЧ мощность в процессе напыления составляла 110 Вт. Отраженная мощность не превышала 4 Вт. Время напыления составляло 1 ч.

Покрытие наносили на предварительно подготовленные шайбы из титана grade-4 диаметром 6 мм (рис. 1). Шайбы располагали на расстоянии 15 см от магнетрона. Рядом с шайбами размещали пластину из шлифованного кремния для последующего анализа скола с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Рис. 1. Титановые материалы с покрытием из гидроксиапатита.

Для сравнительной характеристики биосовместимости вместе с титановыми шайбами, покрытыми ГА, исследовали такие же титановые материалы без покрытия или с медным покрытием. Медное покрытие было нанесено магнетроном на той же установке. Толщина 150 нм.

Перед проведением исследований образцы стерилизовали в 70% спирте в течение 30 мин и затем отмывали 3 раза по 5 мин в изотоническом растворе хлорида натрия («ПанЭко», Россия).

Культивирование ММСК жировой ткани человека. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки из подкожной жировой клетчатки человека (ММСК ЖТ) культивировали в чашках Петри в ростовой среде ДМЕМ/F12 («ПанЭко», Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; «PAA Laboratories», США), 0,584 мг/мл L-глутамина («ПанЭко», Россия), 5000 ед/мл пенициллина («ПанЭко», Россия) и 5000 мкг/мл стрептомицина («ПанЭко», Россия), 10 нг/мл rhFGF-2 («ProSpec», Израиль) и 5000 ед/мл гепарина-натрия («B. Braun Medical Inc.», Германия) при температуре 37 °C и 5% CO₂. Субкультивирование проводили при достижении культурами 80% конфлюентного монослоя. Ростовую среду заменяли каждые 3 сут.

Для исследования биосовместимости тонких функциональных покрытий предварительно простерилизованные материалы помещали на дно 48-луночных планшетов и сверху наслаивали суспензию клеток (по 30 000 клеток на образец).

Адгезия ММСК ЖТ. Для визуализации ММСК ЖТ при флуоресцентной микроскопии клетки окрашивали витальным мембранным красным красителем PKH26 (red fluorescent cell linker kit, «Sigma», США) согласно инструкции производителя. После культивирования ММСК ЖТ на образцах через 1 и 7 сут клетки окрашивали витальным красителем Кальцеин AM («Biotium», США) в концентрации 0,5 мкМ в течение 35 мин при температуре 37 °C для обнаружения живых клеток. Для выявления мертвых клеток использовали флуоресцентный краситель DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) в концентрации 5 мкг/мл в течение 10 мин при температуре 37 °C. Исследуемые материалы с адгезированными клетками переносили в новые лунки 48-луночных планшетов, чтобы исключить из анализа клетки, которые были адгезированы на дне планшетов, и получали изображения клеток, используя автоматизированный имиджер Lionheart FX («BioTek Instruments Inc.», США).

Для количественного анализа клеточной адгезии на поверхности титановых материалов проанализировано 10 полей зрения и оценена относительная площадь слоя клеток в помощью программы ImageJ («NIH», США).

Оценка цитотоксичности материалов методом МТТ-теста. Для проведения МТТ-теста через 1 и 7 сут после инкубации клеток на поверхности материалов в лунки добавляли 0,5 мг/мл МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид, «ПанЭко», Россия) и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37 °C. Затем кристаллы формазана растворяли с помощью ДМСО («ПанЭко», Россия), перемешивая на шейкере в течение 20 мин, измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре xMark («Bio-Rad», США) при длине волны 570 нм и вычитая фоновое значение при 620 нм. Оценивали результаты по отношению к контрольным клеткам, которые культивировали в присутствии титановых материалов без покрытия, и принимали за 100%.

Сканирующая электронная микроскопия. Для проведения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) ММСК на поверхности исследуемых образцов фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида («Panreac», США) в течение 12 ч при температуре 4 °C. После этого образцы промывали фосфатно-солевым буфером («ПанЭко», Россия) и проводили дегидратацию в батарее этанола с возрастающей концентрацией (50%, 75%, 80%, 90%) с последующей обработкой абсолютным этанолом; все этапы выполняли при температуре 4 °C. После образцы высушивали на воздухе.

Перед исследованием образцы напыляли золотом на установке Cressington 108auto («Cressington Scientific Instruments Ltd.», Англия) при 40 мА в течение 40 с, в атмосфере гелия. После напыления образцы фиксировали на сменном предметном столике электронного микроскопа при помощи углеродной токопроводящей клейкой ленты и исследовали на сканирующем электронном микроскопе Phenom ProX («Phenom», Нидерланды) при ускоряющем напряжении 15 кВ с использованием BSE детектора обратно рассеянных электронов (BSE), в режиме «point».

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных данных и построение графиков проводили в программе SigmaPlot v14.0 («Systat Software Inc.», США). Для попарного сравнения экспериментальных групп использовали t-тест, считая различия статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Исследование покрытия. На рис. 2 представлено изображение скола нанесенного покрытия, полученное с помощью СЭМ. Толщина покрытия составила примерно 65 нм, на поверхности имелась шероховатость с характерной высотой 40 нм. Покрытие имело сплошной характер, без трещин и пор. Элементный анализ показал, что соотношение Ca/P составляет 1,67±0,06.

Рис. 2. Скол покрытия из гидроксиапатита на кремниевой пластине. Сканирующая электронная микроскопия.

Исследование цитосовместимости титановых материалов. ММСК ЖТ прикреплялись к поверхности всех исследуемых образцов уже на 1-е сутки (рис. 3, а). При этом визуально плотность расположения клеток на титановых шайбах, покрытых ГА, и шайбах без покрытия не различалась. Большинство адгезированных клеток были живыми, что подтверждалось окрашиванием Кальцеином AM, наблюдались единичные мертвые ММСК ЖТ, окрашенные DAPI. На поверхности титановых шайб, покрытых медью, общее число адгезированных клеток на 1-е сутки было значительно меньше, чем на покрытых материалами других типов, и контролем, а также обнаружено большее количество мертвых клеток.

Рис. 3. Адгезия ММСК ЖТ на поверхности исследуемых материалов через 1 и 7 сут.

а, б — ММСК ЖТ, окрашенные PKH26 (красный), живые клетки, окрашенные кальцеин АМ (зеленый), и мертвые клетки, окрашенные DAPI (синий), флуоресцентная микроскопия, ув. ×4; в — количественная оценка плотности клеток на поверхности материалов (p<0,05 по сравнению с титаном без покрытия). ММСК ЖТ — мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани.

Через 7 сут общее количество клеток на поверхности титановых матриксов существенно увеличилось, что свидетельствует об их активной пролиферации (рис. 3, б). Наблюдаемое увеличение количества мертвых клеток, окрашенных DAPI, может быть связано с высокой плотностью расположения ММСК ЖТ. При этом большинство клеток оставались жизнеспособными, окрашенными Кальцеин AM, что свидетельствует о цитосовместимости и выраженных адгезивных свойствах титановых материалов как покрытых ГА, так и без покрытия. Плотность расположения клеток на материалах, покрытых медью, через 7 сут не изменилась по сравнению с таковой в 1-е сутки; кроме того, существенно увеличилось количество мертвых клеток.

По результатам количественной оценки плотности расположения клеток на поверхности материалов обнаружено статистически значимое увеличение в 1,7±0,4 раза количества клеток на материалах, покрытых ГА, по сравнению с контрольными титановыми шайбами (рис. 3, в).

По результатам способности к поддержанию клеточной адгезии материалы, покрытые медью, были исключены из дальнейшего исследования.

Адгезия ММСК ЖТ на титановых материалах, покрытых ГА, была также исследована методом СЭМ. ММСК ЖТ прикреплялись к поверхности титановых материалов и имели характерную распластанную морфологию уже на 1-е сутки (рис. 4, а). Наблюдалось значительное увеличение плотности клеточного слоя через 7 сут по сравнению с таковой в 1-е сутки (рис. 4, б), что свидетельствует о пролиферации клеток на материалах. На всех образцах встречались области с низкой плотностью клеточного слоя, обычно расположенные ближе к краю образца. На основании изображений СЭМ можно сделать вывод, что титановые материалы с ГА и без покрытия не имели выраженных различий.

Рис. 4. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани на поверхности титановых материалов через 1 (а) и 7 (б) сут. Сканирующая электронная микроскопия.

По результатам МТТ-теста также не обнаружено статистически значимых различий по цитосовместимости титановых материалов с ГА и без покрытия как на 1-е, так и на 7-е сутки (рис. 5). При этом наблюдалась тенденция к увеличению числа жизнеспособных клеток при инкубации на титановых материалах, покрытых ГА. После инкубации ММСК ЖТ с исследуемыми образцами относительное количество живых клеток на 1-е сутки составляло 100,0±10,6 и 102,4±3,5% для титановых матриксов без покрытия и с покрытием соответственно. Через 7 сут наблюдалось существенное увеличение общего количества клеток в лунках, что может свидетельствовать об отсутствии цитотоксического действия исследуемых материалов. При этом относительное количество живых клеток на 7-е сутки составляло100,0±5,6 и 108,5±8,7% для титановых материалов с ГА и без покрытия соответственно.

Рис. 5. Относительное количество живых клеток через 1 и 7 сут после культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани с титановыми материалами. МТТ-тест.

Титановые имплантаты и без напыления имеют высокую цитосовместимость, поэтому достоинства нанесения ГА, вероятно, связаны с изменением микрорельефа поверхности, характерным для костной ткани составом и сорбционными свойствами, которыми не обладают титановые матриксы без покрытия. В то же время материалы из ГА позволяют связывать лекарственные средства [13, 14]. Поэтому такие покрытия перспективны в качестве депо для лекарственных средств, в том числе остеоиндуктивного действия для заполнения костных дефектов.

Заключение

В результате проведенного исследования показана высокая цитосовместимость титановых матриксов после покрытия гидроксиапатитом, нанесенного высокочастотным магнетронным напылением при низких давлениях в атмосфере инертного газа. Наблюдалось статистически значимое увеличение количества адгезированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из подкожной жировой клетчатки человека на поверхности матриксов с гидроксиапатитом, по сравнению с титановыми материалами без покрытия.

В связи с тем что титановые имплантаты и без напыления имеют высокую цитосовместимость, достоинства нанесения покрытия гидроксиапатитом связаны с обеспечением возможности адгезировать лекарственные средства или остеоиндукторы, что может быть реализовано в будущих биологически-активных дентальных имплантатах.

Работа выполнена при финансовой поддержке ООО «Плазтрек» и государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ «МГНЦ».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.