Использование дентальных имплантатов в качестве внутрикостной опоры для протезирования пациентов с дефектами зубных рядов получило широкое распространение в силу наиболее физиологичного и комфортного для пациента способа восстановления жевательной эффективности. Несмотря на относительную «простоту» хирургического этапа при условии достаточного объема костной ткани, дентальная имплантация, как любая другая хирургическая манипуляция в полости рта, сопряжена с рисками гнойно-воспалительных осложнений [1]. Существует ряд мероприятий, направленных на снижение данных рисков: строгое выполнение всех требований асептики и антисептики, стоматологическая санация до операции, использование антибиотиков до, во время и (или) после операции [2, 3]. Среди перечисленных мер наиболее дискутабельной остается антибиотикопрофилактика, поскольку существует большое количество публикаций, которые разнятся в своих выводах как относительно предпочтительного антибиотика, так и относительно режима дозирования и длительности приема [4—6]. Кроме того, имеющиеся публикации носят преимущественно клинический характер, что позволяет оценить видимые симптомы при сравнении пациентов в группах. Однако такой подход не позволяет на более глубоком уровне сравнить возможные различия при использовании разных схем приема антибиотика.

Поскольку экспериментальное подтверждение различий или их отсутствия между группами было бы убедительным основанием для выбора той или иной схемы использования антибиотиков, было принято решение провести исследование о наличии или отсутствии следов антибиотика в ткани имплантато-костных биоптатов с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния. Спектроскопия комбинационного рассеяния — это спектроскопический метод исследования, который используется для изучения молекулярной структуры или химической идентификации исследуемого образца за счет определения колебательных мод молекул и вибрационных мод в твердых телах. Таким образом, с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния можно идентифицировать химические компоненты, т.е. определять природу вещества, за счет наблюдения в полученном спектре положения и интенсивности спектральных полос. Кроме того, спектроскопия комбинационного рассеяния имеет значительные преимущества по сравнению с другими аналитическими методами, такие как простота пробоподготовки и большой объем получаемой информации.

Данный метод анализа имеет высокую чувствительность при определении химических компонентов, так как не существует двух молекул, которые имеют одинаковые спектры комбинационного рассеяния, а интенсивность спектральных полос связана с количеством вещества. Это позволяет провести качественный и количественный анализ исследуемого вещества, а в нашей работе — дифференцировать наличие или отсутствие в ткани антибиотика.

Цель исследования — определить наличие антибиотика на основе амоксициллина в имплантато-костных биоптатах методом рамановской спектроскопии в эксперименте.

Материал и методы

Работу проводили на базе вивария Федерального государственного научного учреждения науки «Научного центра биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства России. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище, что соответствует ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Содержание животных и проведение эксперимента осуществлялось при соблюдении правил гуманного обращения с животными в соответствии с нормативными документами: Приказ Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Исследование одобрено Межвузовским этическим комитетом Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

В качестве антибиотика был выбран амоксициллин, защищенный клавулановой кислотой (Амоксигард Nita-Farm, Россия), который используют как «золотой стандарт» для антибиотикотерапии в стоматологической практике. Сравнительная оценка разных схем использования амоксициллина/клавуланата была выполнена в эксперименте на модели лабораторного животного — миниатюрной свиньи светлогорской породы. Животные были разделены на 2 группы по 5 животных в группе. Первой группе животных за 30 мин до операции было введено 2 мл на 20 кг массы тела животного, что соответствует однократной профилактической дозе антибиотика, назначаемой пациентам до операции дентальной имплантации. Вторая группа животных за 30 мин до разреза получила профилактическую дозировку антибиотика — 2 мл на 20 кг массы тела и далее по 1 мл на 20 кг массы тела в течение 5 дней, согласно инструкции производителя, что соответствует пролонгированной схеме приема антибиотика у пациентов. Далее всем животным было установлено по 6 дентальных имплантатов (размер дентального имплантата 3,75/6 мм) в позиции ранее удаленных резцов верхней челюсти (рис. 1). Дентальные имплантаты устанавливали по стандартному протоколу с использованием имплантологического набора фирмы-производителя с помощью физиодиспенсера угловым наконечником 20:1 под постоянным охлаждением физиологическим раствором. Края раны сопоставляли и фиксировали узловыми швами нерезорбируемой нитью размером 4-0. Затем, на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е сутки у каждого животного с помощью физиодиспенсера угловым наконечником 20:1 под постоянным охлаждением физиологическим раствором с помощью фрезы-трепан с алмазным напылением (длина 10 мм, внутренний диаметр 9 мм; ООО «Механика здоровья», Россия) выполнялось взятие имплантато-костного трепан-биоптата, включающего в себя дентальный имплантат (рис. 2), а также окружающую костную ткань не менее 2 мм с каждой стороны имплантата (рис. 3, 4).

Рис. 1. Дентальные имплантаты, установленные в переднем отделе верхней челюсти.

Рис. 2. Формирование имплантато-костного трепан-биоптата.

Рис. 3. Имплантато-костный трепан-биоптат. Вид сверху.

Рис. 4. Имплантато-костный трепан-биоптат. Вид сбоку.

Каждое хирургическое вмешательство проводили с использованием комбинации препаратов Золетил 100 (Virbac, Франция) в дозировке 15—25 мг/кг внутримышечно, Ксила (Interchemie Werken «de Adelaar» BV, Нидерланды) в дозировке 0,1 мл/кг внутримышечно, атропина сульфат (Дальхимфарм ОАО, Россия) в дозировке 0,04 мг/кг внутримышечно и местной анестезии препаратом на основе артикаина с концентрацией адреналина 0,005 мг/мл (1:200 000) (Septodont, Франция). Послеоперационно проводили анальгезирующую терапию препаратом Кеторолак 10 мг/мл внутримышечно (Sandoz, Словения). Перед каждым хирургическим вмешательствам животным проводили антисептическую обработку полости рта 0,05% раствором хлоргексидина в течение 1 мин.

Полученные имплантато-костные трепан-биоптаты помещали в 10% нейтральный формалин и фиксировали 24 ч. Затем осуществляли промывку в проточной воде в течение 3 ч. После чего образцы тканей помещали в абсолютированный изопропанол (Биовитрум, Россия), который сменяли трехкратно. Обезжиривание осуществляли ортоксилолом с его двухкратной сменой. Затем проводили пропитку раствором Technovit 9100 (Германия) с последовательной его трехкратной сменой. Полимеризацию выполняли согласно инструкции производителя в аппарате Technomat (Германия) в условиях повышенного давления (2 Бар) в течение 10 мин. Готовые блоки, содержащие образцы тканей, обрезали, удаляя излишний пластик и формировали заготовки для последующей микросекции. Микросекцию блоков осуществляли с использованием режущего станка Isomet 4000 (Buechler, USA). В результате получали гистологические срезы толщиной 100 мкм, которые приклеивали акрилатным клеем к стеклу и шлифовали на полировальных кругах с последовательной сменой зернистости с 200 до 1200.

Спектральный анализ комбинационного рассеяния был проведен на всех полученных микропрепаратах имплантато-костных трепан-биоптатов (n=60; 1-я группа — 30 микропрепаратов, 2-я группа — 30 микропрепаратов): препарата «кости без антибиотика», «амоксициллин» «стекло с клеем». Последний микропрепарат был необходим для получения спектра материалов, которые использовались для заготовки микропрепаратов костной ткани.

Спектры комбинационного рассеяния были получены на приборе DXRTM 2 Raman Microscope (Thermo Fisher Scientific, MA, USA), оснащенном лазером длиной волны 780 нм и мощностью 15 мВ. Лазерный луч фокусировался через объектив оптического микроскопа с увеличением ×50 в пятно размером 0,8 мкм на исследуемом участке (рис. 5). Время накопления для каждого спектра составляло около 6 с.

Рис. 5. Микропрепарат имплантато-костного трепан-биоптата в окне программы Origin (2021, 9.8.0 Build 200).

Разложение и оценка полосы в спектре биоптатов проводились с помощью анализа пикового соответствия спектра комбинационного рассеяния в программах Origin (9.8.0 Build 200) и OMNIC (Dispersive Raman).

Результаты и обсуждение

Рис. 6 представляет спектры комбинационного рассеяния микропрепаратов «амоксициллин», «кость без антибиотика», «стекло с клеем». Проводили поиск наиболее интенсивных полос, которые могли бы соответствовать спектрам собственно амоксициллина, чистой кости без антибиотика, а также стекла с клеем. При нахождении подобных полос выполнялось сопоставление с данными литературы, чтобы подтвердить, что результаты соответствуют данным, полученным в других исследованиях. На основании проведенного анализа пикового соответствия было установлено, что характерная и интенсивная полоса спектра комбинационного рассеяния препарата «стекло с клеем» лежит близко к значению сдвига по частоте 1450 см^–1. На рисунке пик, соответствующий препарату «стекло с клеем», находится в спектре 1457 см^–1. Спектр препарата «кости без антибиотика» находится около сдвига по частоте 1447 см^–1. Спектр препарата «амоксициллин» находится около сдвига по частоте 1437 см^–1 (рис. 6). Все указанные результаты хорошо коррелируют с данными, полученными в других исследованиях [7, 8].

Рис. 6. Спектры комбинационного рассеяния: (a) амоксициллина, (b) кости без антибиотика, и (c) стекла с клеем.

Важно, что при рамановской спектроскопии препарата «стекло с клеем» получили высокую интенсивность и широкий пик, а соответствующие пики препаратов «амоксициллин» и «кость без антибиотика» имели значительно меньшую интенсивность и ширину. Тем самым, очевидными стали сложности для дифференцировки наличия или отсутствия антибиотика в кости, так как соответствующие пики у препаратов «кость без антибиотика» и «амоксициллин» имеют значительно меньшую интенсивность и ширину, и пик препарата «стекло с клеем» может поглощать их.

Затем при анализе имплантато-костных биоптатов в каждом случае была получена широкая интенсивная полоса (от ≈1250 см^–1 до ≈1870 см^–1), расположенная одновременно в областях соответствия препаратам «амоксициллин», «кость без антибиотика», «стекло с клеем» (рис. 7). Таким образом, для уточнения спектров комбинационного рассеивания необходимо было выполнить разложение наблюдаемой в спектре биоптатов широкой полосы, поскольку предполагалось, что внутри нее могут находиться интересующие нас полосы, а именно, амоксициллина, клея на стекле и чистой кости.

Рис. 7. Спектры комбинационного рассеяния препаратов лабораторных животных.

a — однократная схема, 1-е сутки после операции; b — однократная схема, 3-и сутки после операции; с — однократная схема, 7-е сутки после операции; d — однократная схема, 14-е сутки после операции; e — пролонгированная схема, 1-е сутки после операции; f — пролонгированная схема, 3-и сутки после операции; g — пролонгированная схема, 7-е сутки после операции; h — пролонгированная схема, 14-е сутки после операции), а также (i) амоксициллина, (j) кость без антибиотика, и (k) стекла с клеем.

Выбранный интервал сдвига по частоте для анализа составил от 1400 см^-1 до 1600 см^–1, так как искомые полосы исследуемых веществ лежат в данном интервале.

Среди лабораторных животных 1-й группы (однократный прием антибиотика) наиболее вероятное обнаружение амоксициллина было в 1-е сутки после дентальной имплантации так как это ближайшая точка взятия биоптата после введения антибиотика. На рис. 8 представлен результат анализа пикового соответствия после разложения наблюдаемой интенсивной полосы биоптата вслед за приемом амоксициллина на 1-е сутки после операции. На рисунке заметно, что наиболее близкий к интересующим нас пик находится на сдвиге 1448 см^–1, скорее соответствующий спектру костной ткани без антибиотика, чем амоксициллину. Таким образом, можно говорить о том, что в данных образцах не содержится искомый антибиотик.

Рис. 8. Результат анализа пикового соответствия после приема амоксициллина на 1-е сутки после операции.

Среди животных 2-й группы (пролонгированная схема) наиболее вероятно амоксициллин мог быть обнаружен на 3-и сутки после операции, так как в данной группе к этому времени уже должно было произойти достаточное накопление препарата. Однако полученные данные говорят о том, что пик, наиболее близкий к интересующим нас значениям, соответствует 1446 см^–1, и так же как и в 1-й группе скорее, относится к спектру костной ткани, что указывает на отсутствие антибиотика в изучаемых образцах (рис. 9).

Рис. 9. Результат анализа пикового соответствия после пролонгированного приема амоксициллина на 3-е сутки после операции.

Вместе с тем, в ходе эксперимента нами не было получено гнойно-воспалительных осложнений в области раны ни у одного из животных обеих групп ни на одном из сроков наблюдений. В связи с этим можно предположить, что концентрация антибиотика, циркулирующая в кровяном русле, которая достигает своего пика через 40—60 мин после введения, является достаточной для профилактики воспалительных осложнений.

Спектральный анализ комбинационного рассеяния является эффективным методом для определения антибиотика в тканях, о чем свидетельствуют множественные публикации на тему определения антибиотика в разных средах [9]. В рамках нашего исследования молекулы амоксициллина не были обнаружены, что может быть объяснено тем, что амоксициллин лишь в небольшом количестве проникает в межклеточное вещество костной ткани, а потому и попытка его определения в имплантато-костном биоптате с помощью спектрального анализа комбинационного рассеяния не показала результата вне зависимости от схемы приема препарата.

Заключение

Наличие антибиотика на основе амоксициллина в имплантато-костных биоптатах методом рамановской спектроскопии в эксперименте на модели миниатюрной свиньи обнаружено не было ни на одном из сроков исследования, вне зависимости от режима приема и дозирования антибиотика. Обнаруженные пики соответствовали костной ткани без антибиотика.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.