Заживление дефектов костной ткани, полученных в результате травмы или оперативного вмешательства, является серьезной проблемой в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Генная терапия является новым подходом, позволяющим значительно ускорить процесс восстановления костей за счет целенаправленной доставки генов остеогенных белков [1]. В связи с этим активно разрабатываются ген-активированные остеопластические материалы, представляющие собой биорезорбируемые биосовместимые матриксы, импрегнированные генетическими конструкциями. Однако, несмотря на большое количество работ в этой области, выбор компонентов материала, а также методов получения из них эффективных ген-активированных матриксов (ГАМ) все еще остается актуальной задачей [2].
В качестве векторов для доставки генетического материала в последнее время все больше внимания уделяется аденовирусным конструкциям, не обладающим способностью встраивать ДНК в геном клетки-хозяина, что обеспечивает достаточно высокий уровень безопасности их применения. Кроме того, аденовирусы могут трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и характеризуются высокой пакующей емкостью, что является их преимуществами по сравнению с другими часто используемыми вирусными векторами [3].
Для обеспечения локализованной доставки генетических конструкций в зону костного дефекта необходимо использование матриц-носителей, которые также будут выполнять и остеокондуктивную функцию. Большой интерес представляют синтетические полимеры, которые могут быть получены в необходимом количестве, а их структура и состав могут быть легко модифицированы. Распространенным синтетическим полимером, используемым для регенерации костной ткани, является сополимер молочной и гликолевой кислот (поли(L-лактид-со-)гликолид, PLGA) благодаря его высокой биосовместимости и способности к биорезорбции [4].
При разработке ген-активированных остеопластических материалов важной характеристикой является структура матриц-носителей, которая обеспечивает диффузию питательных веществ, миграцию клеток и прорастание сосудов, а также контролируемое высвобождение введенных в состав матрикса биологически-активных молекул [5]. Применение подходов трехмерной (3D) печати позволит решить эту проблему, позволяя строго задавать микро- и макроархитектонику матриц-носителей. Кроме того, такие 3D-матриксы могут быть смоделированы в соответствии с геометрией дефектов каждого конкретного пациента, что способствует оптимальной интеграции имплантата с окружающими тканями и быстрому заживлению костной ткани [6].
Цель работы — in vitro-исследование свойств трехмерных матриксов на основе полилактогликолида и аденовирусных конструкций с геном GFP на культурах мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани.
Материал и методы
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) получали из жировой ткани (ЖТ) крыс по описанной ранее методике [7] и культивировали в среде ДМЕМ/F12 (НПП «ПанЭко», Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (PAA laboratories, Канада), 0,584 мг/мл L-глутамина (Панэко, Россия), 5000 ед/мл пенициллина (НПП «ПанЭко», Россия) и 5000 мкг/мл стрептомицина (НПП «ПанЭко», Россия) при 37 °C и 5% CO2.
Аденовирусная трансдукция
В работе использовали аденовирусные векторы с геном зеленого флуоресцентного белка (Ad-GFP). Для определения концентрации аденовирусных частиц отбирали 200 мкл суспензии вирусов, выделяли ДНК с помощью набора QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя и оценивали концентрацию вирусной ДНК на спектрофотометре Nano Drop OneC (Thermo Fisher Scientific, США) при 260 нм.
ММСК ЖТ трансдуцировали в среде ДМЕМ/F12 с антибиотиком и 2% ЭТС в течение 24 ч. Эффективность трансдукции клеток оценивали визуально по флуоресценции белка GFP на автоматизированном микроскопе Lionheart FX (Agilent BioTek, США) и методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитофлуориметре CytoFLEX (Beckman coulter, США).
3D-матриксы на основе полилактогликолида
В качестве материала для формирования матриксов использовали сополимер молочной и гликолевой кислот — полилактогликолид (Purasorb PDLG 7507, Corbion Purac, Нидерланды) с соотношением звеньев лактид/гликолид 75/25. Для получения 10 масс.% раствора 1 г PLGA смешивали с 9 г тетрагликоля (Sigma-Aldrich, США) с помощью магнитной мешалки (FlatSpin, Китай) в течение 2 дней при комнатной температуре. Формирование трехмерных матриксов проводили на 3D-принтере, разработанном и изготовленном во ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН [8]. Методом антисольвентной трехмерной печати при 25 °C были сформированы PLGA-матриксы с характерным диаметром волокна 350±20 мкм.
Для оценки цитотоксичности полученных 3D-матриксов на основе PLGA ММСК ЖТ высевали на дно 24-луночных планшетов с системой Transwell, с порами 8 мкм (SPL Lifesciences, Корея), через 24 ч помещали матриксы в верхние вкладыши и инкубировали в ростовой среде в течение 14 сут. По окончании эксперимента методом МТТ-теста оценивали относительную жизнеспособность клеток.
Для оценки цитосовместимости 3D-матриксы на основе PLGA помещали на дно лунок 24-луночных планшетов, сверху наслаивали суспензию клеток, предварительно окрашенных витальным мембранным красным красителем PKH-26 (red fluorescent cell linker kit, Sigma, США) в соответствии с инструкцией производителя. ММСК ЖТ инкубировали в присутствии матриксов на протяжении 1 и 14 сут и по окончании эксперимента с целью выявления живых клеток их окрашивали витальным красителем 0,5 мкМ кальцеин АМ (Biotium, США) в течение 35 мин при 37 °C. Для выявления апоптотических клеток использовали флуоресцентный краситель DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 мин. Анализ проводили с помощью микроскопа Lionheart FX.
Для получения ген-активированных 3D-матриксов на основе PLGA их смачивали в суспензии Ad-GFP в течение 24 ч. После чего оценивали эффективность трансдукции ММСК ЖТ аденовирусными векторами, высвободившимися из матриксов методом флуоресцентной микроскопии.
Для оценки кинетики высвобождения аденовирусных частиц из 3D-матриксов на основе PLGA матриксы помещали в пробирки с 2 мл физиологического раствора (НПП «ПанЭко», Россия) и инкубировали в течение трех недель, отбирая по 100 мкл раствора каждые 3 сут. Затем из отобранных аликвот выделяли вирусную ДНК с помощью набора QIAamp MinElute Virus Spin Kit согласно инструкции производителя и оценивали концентрацию ДНК на спектрофотометре Nano Drop OneC при 260 нм.
Статистический анализ
Статистический анализ и построение графиков выполняли с помощью программы SigmaPlot v14.0 (Systat Software Inc., США). Группы сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна—Уитни. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Оценка эффективности аденовирусной трансдукции ММСК ЖТ в зависимости от концентрации вируса
При увеличении концентрации Ad-GFP в культуральной среде эффективность аденовирусной трансдукции клеток возрастала (рис. 1, а, б). Через 3 сут после инкубации ММСК ЖТ с 10 нг/мкл Ad-GFP наблюдалось 44,1±2,2% трансдуцированных клеток, а увеличение концентрации вирусов до 50 нг/мкл и 100 нг/мкл Ad-GFP приводило к трансдукции 75,8±5,7% и 80,4±4,4% клеток соответственно. При этом не было выявлено статистически значимых отличий в количестве трансдуцированных клеток после инкубации ММСК ЖТ с 50 нг/мкл и 100 нг/мкл Ad-GFP через 1 сут, и через 3 сут (рис. 1, б). Введение больших концентраций вирусных векторов нежелательно для клинического применения, поскольку аденовирусы могут вызывать воспалительную реакцию за счет иммуногенности капсида вируса [9]. Кроме того, показано, что высокие концентрации аденовирусных частиц могут приводить к снижению жизнеспособности ММСК [10]. Поэтому для обеспечения эффективной трансдукции ММСК ЖТ были выбраны аденовирусные суспензии с концентрацией 50 нг/мкл вирусной ДНК.
Рис. 1. Эффективность доставки гена GFP в ММСК ЖТ через 1 и 3 суток после инкубации клеток с различными концентрациями Ad-GFP.
а — флуоресцентная и фазово-контрастная микроскопия. Масштабный отрезок 100 мкм; б — проточная цитофлуориметрия. p<0,05 по сравнению с 10 нг/мкл Ad-GFP.
Оценка цитосовместимости 3D-матриксов на основе PLGA
Показано, что 3D-матриксы на основе PLGA не обладают цитотоксическим действием in vitro. Не было выявлено статистически значимых отличий в числе живых ММСК ЖТ по сравнению с контролем через 1 и 14 сут инкубации клеток в присутствие матриксов (рис. 2, а). По результатам флуоресцентной микроскопии через 24 ч инкубации не было обнаружено мертвых клеток, окрашенных DAPI, а через 14 сут наблюдалось существенное увеличение плотности живых клеток, при этом число ММСК ЖТ, окрашенных DAPI, соответствовало аналогичному количеству в контрольной группе (рис. 2, б).
Рис. 2. Оценка цитосовместимости 3D-матриксов на основе PLGA на ММСК ЖТ.
а — относительная жизнеспособность клеток, МТТ-тест; б — ММСК ЖТ, окрашенные PKH-26 (красный), живые клетки, окрашенные кальцеином AM (зеленый), и мертвые клетки, окрашенные DAPI (синий), флуоресцентная микроскопия. Масштабный отрезок 100 мкм.
Биосовместимость является одной из основных характеристик при выборе материала для биомедицинского применения. Безопасность полимера PLGA была подтверждена в различных исследованиях как in vitro, так и in vivo [11]. Полученные нами матриксы на основе PLGA, сформированные методом трехмерной антисольвентной печати, также продемонстрировали высокую цитосовместимость на культуре клеток ММСК ЖТ.
Оценка эффективности трансдукции ММСК ЖТ аденовирусами, импрегнированными в 3D-матриксы на основе PLGA
Для включения Ad-GFP в структуру матриксов на основе PLGA матриксы инкубировали в вирусной суспензии в течение 24 ч. Полученные таким образом ГАМ обеспечивают полное высвобождение аденовирусных частиц в течение недели, что свидетельствует о плавной кинетике выхода частиц. При этом на первые сутки высвобождается порядка 30% векторов, а к 4-му дню этот показатель составляет 95% (рис. 3). При включении 125 нг/мкл Ad-GFP в матриксы через 1 сут высвобождается 33,8±0,8 нг/мкл (см. таблицу), что близко к подобранной концентрации вирусных векторов для трансдукции ММСК ЖТ (см. рис. 1). При инкубации ММСК ЖТ в присутствии ГАМ, начиная с 4 суток, выявляются трансдуцированные клетки, продуцирующие GFP. В результате аденовирусные конструкции, высвобождающиеся из 3D-матриксов, обладают трансдуцирующей способностью на протяжении исследуемого периода (рис. 4).
Рис. 3. Кинетика высвобождения Ad-GFP из 3D-матриксов на основе PLGA. Спектрофотометрия.
Высвобождение аденовирусных конструкций из 3D-матриксов на основе PLGA
| Срок | Концентрация, нг/мкл |
| Исходная | 125,0 |
| 1-е сутки | 33,8±0,8 |
| 4-е сутки | 116,9±4,6 |
| 7-е сутки | 121,3±4,0 |
Рис. 4. Эффективность трансдукции ММСК ЖТ аденовирусами, импрегнированными в 3D-матриксы на основе PLGA, флуоресцентная и фазово-контрастная микроскопия.
Масштабный отрезок 100 мкм.
Заключение
Матриксы на основе PLGA, полученные методом антисольвентной 3D-печати, показали высокую цитосовместимость. Включение модельных аденовирусных векторов с геном GFP в состав полученных PLGA матриксов приводит к получению ГАМ, обеспечивающих пролонгированное высвобождение вирусных частиц в течение недели, сохраняющих их высокую трансдуцирующую способность. Таким образом, разработанный метод изготовления ген-активированных 3D-матриксов на основе PLGA и аденовирусных частиц представляет собой новый перспективный подход для получения высокоэффективных биосовместимых остеопластических материалов с целью применения в клинической практике врачей-стоматологов, челюстно-лицевых хирургов и других специалистов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант №22-15-00425).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.