В клинической лабораторной практике широко используется определение медиаторов воспаления в биологических жидкостях полости рта. Измерение концентрации цитокинов, белков острой фазы воспаления, антимикробных пептидов в слюне и десневой жидкости, экссудате позволяет контролировать степень воспаления, эффективность лечения, мониторировать состояние в период реабилитации и прогнозировать обострения хронических воспалительных заболеваний полости рта [1]. Однако воспалительные процессы в ротовой полости часто сопряжены с деструктивными процессами в костной ткани пародонта, периимплантационной области, альвеолярной части челюстей [2]. Для контроля поражения костной ткани в стоматологии используется широкий спектр методов лучевой диагностики, преимущественно компьютерная томография [3]. При диагностике первичных и метастатических поражений костной ткани челюстей также востребованы методы визуальной диагностики: спиральная компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, остеосцинтиграфия, однофотонная эмиссионная компьютерная томография, совмещенная с рентгеновской компьютерной томографией, позитронно-эмиссионная томография [4]. Информационный потенциал определения остеомаркеров в жидкостях полости рта остается невостребованным как при воспалительных, так и при опухолевых заболеваниях. Между тем остеомаркеры являются чувствительными индикаторами состояния ремоделирования кости, баланса между остеорезорбтивными и остеообразующими процессами [5, 6], их определение неинвазивно, не требует дорогостоящей аппаратуры и может выполняться в любой лаборатории с сертифицированным аппаратным обеспечением для иммуноферментного анализа. Часто изменения концентрации остеомедиаторов в биологических жидкостях происходят раньше, чем выявляется остеодеструкция, например, при лучевых методах исследования [7].
Цель исследования — определение информативности оценки биохимических маркеров в десневой жидкости при деструктивных костных изменениях в периимплантационной области, первичном опухолевом поражении альвеолярной части челюстей и метастастической деструкции костной ткани челюстей при раке больших слюнных желез.
Материал и методы
Проведено многоцентровое исследование, одобренное локальным независимым этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Минздрава России и ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России.
Всего в исследовании участвовали 66 пациентов в возрасте от 30 до 75 лет, мужчины и женщины. В зависимости от генеза деструкции костной ткани нижней челюсти выделяли три группы: 1-я — 20 пациентов с периимплантитом; 2-я — 22 пациента, у которых диагностирован рак слизистой оболочки дна полости рта (МКБ С04) с эрозией кортикальной кости; 3-я — 9 больных с аденокарциномой больших слюнных желез с метастатическим поражением нижней челюсти.
Для определения нормальных уровней исследуемых остеомаркеров была сформирована группа контроля, которая включала 15 практически здоровых лиц без тяжелой соматической патологии и заболеваний пародонта (8 мужчин и 7 женщин в возрасте 40—60 лет).
Стоматологическое обследование всех пациентов проходило по стандартному протоколу, в том числе с определением глубины периимплантационных карманов, дефектов костной ткани согласно нозологии.
Критерии включения пациентов в 1-ю группу: дентальный периимплантит (МКБ К05.3); возраст больных 30—75 лет, локализация — нижняя челюсть.
Критерии включения пациентов во 2-ю группу: рак слизистой оболочки дна полости рта (МКБ С04) с эрозией кортикальной кости; возраст больных 75 лети моложе; отсутствие до момента исследования специализированного лечения онкологического заболевания.
Критерии включения пациентов в 3-ю группу: костные метастазы в нижнюю челюсть у больных аденокарциномой больших слюнных желез — околоушной (n=5), подчелюстной (n=2) и подъязычной (n=2); возраст больных 75 лет и моложе.
Критерии исключения: тяжелая общесоматическая патология — ВИЧ, СПИД, сопутствующая патология с декомпенсацией дыхательной, сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем, системный прием стероидных или нестероидных противовоспалительных препаратов.
Средний возраст пациентов 1-й группы составлял 45,8±2,2 года (медиана 46 лет), 2-й группы — 53,2±2,5 года (медиана 51 год), 3-й группы — 55,7±2,3 года (медиана 56 лет). В 1-ю группу вошли 14 (70%) женщин и 6 (30%) мужчин, во 2-ю группу — 15 (68%) мужчин и 7 (32%) женщин, в 3-ю группу — 7 (78%) мужчин и 2 (22%) женщины.
В 1-й группе пациентам ранее устанавливали внутрикостные дентальные имплантаты системы Astra Tech (n=13; 65%). У остальных больных использовали имплантаты системы Thommen Medical (n=7; 35%). Длина имплантатов колебалась от 3,8 до 4,5 мм, высота — от 6 до 11 мм.
Во 2-ю группу согласно классификации стадий развития злокачественных опухолей TNM (8-е издание) включали больных с умеренно местно-распространенным раком T4aN0—2M0. Наличие только поверхностных эрозий кортикальной кости первичной опухолью было недостаточным признаком для ее классифицирования как стадии Т4b. Согласно критериям гистопатологической дифференцировки у 15 (68%) пациентов наблюдалась низкая и у 7 (32%) средняя степень дифференцировки опухолевых клеток.
В 3-й группе распространенность злокачественных опухолей больших слюнных желез была Т4а—bN1—2M1. Диагностированы отдаленные метастазы в костной ткани челюсти (тело и угол нижней челюсти; n=4), а также одновременно в нижней челюсти и легких (n=5). Степень дифференцировки опухолевых клеток у всех пациентов была низкой.
Лабораторную часть исследования проводили с привлечением иммуноферментного и биохимического анализа. В качестве исследуемого материала использовали десневую жидкость или экссудат периимплантационных карманов. Сбор жидкости осуществляли при помощи пинцета стерильным бумажным эндодонтическим штифтом размером №25, помещая его в карман или зубодесневую борозду не менее чем на 10 с на максимальную глубину. Объем экссудата определяли по разнице весов бумажного штифта до и после сорбции экссудата.
Содержание катепсина К в десневой жидкости определяли с помощью набора реактивов Cathepsin K (CTSK) (Human) ELISA Kit (Cloud-Clone Corp., США). Для определения концентрации тартратрезистентной кислой фосфатазы (ТРКФ) использовали набор реактивов Bone TRAP (TRAP5b) Assay (Immunodiagnostic Systems, IDS, Англия). TRACP 5b представлял собой активный фермент, выделяющийся из остеокластов. Для иммуноферментного анализа использовали фотометр Multiscan-Р 2 (Thermo Fisher Scientific Inc., Финляндия) при длине волны 450 нм. Определение активности костной фракции щелочной фосфатазы проводили кинетическим методом. Активность щелочной фосфатазы в биологической жидкости определяли путем измерения скорости гидролиза эфира фосфорной кислоты — n-нитрофенилфосфата с получением n-нитрофенола и фосфорной кислоты. Скорость гидролиза субстрата прямо пропорциональна активности фермента.
Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью программы Statistica 12.0 (StatSoft Inc., США) и применением теста на нормальность с использованием критерия Шапиро—Уилка, описательной статистики, дисперсионного анализа.
Результаты и обсуждение
У пациентов контрольной группы в десневой жидкости концентрация катепсина К составила 1,71±0,34 пмоль/л (медиана 1,8 пмоль/л), ТРКФ 3,7±0,5 ед/л (медиана 3,64 ед/л), активность костной фракции щелочной фосфатазы (КЩФ) была 4,2±0,6 мкмоль/л (медиана 4,11 мкмоль/л). Полученные значения использовали в качестве контрольных.
Об активности резорбции альвеолярной части нижней челюсти судили по концентрации в содержимом периимплантационной лизосомального фермента катепсина К и фермента шероховатого эндоплазматического ретикулума ТРКФ, которые высвобождаются при активации остеокластов в костные лакуны и участвуют в резорбции кости [8—12].
В 1-й группе в экссудате периимплантационной зоны содержание катепсина К (4,7±0,4 пмоль/л) возрастало по сравнению с таковым в группе контроля в 2,5 раза (p<0,001) (таблица). Многократное превышение концентрации катепсина К в десневой жидкости было установлено как во 2-й группе при раке слизистой оболочки дна полости рта с распространением на альвеолярную часть (11,4±0,6 пмоль/л), так и в 3-й группе при метастатическом поражении челюсти (20,7±1,2 пмоль/л) (см. таблицу). Содержание катепсина К в десневой жидкости во 2-й группе по сравнению с группой контроля было выше в 6,6 раза (p<0,001), а в 3-й группе — в 11,2 раза (p<0,001) (рисунок).
Концентрация остеомаркеров в содержимом периимплантационной борозды и в десневой жидкости в клинических группах
| Показатель | Величина | 1-я группа, n=20 | 2-я группа, n=22 | 3-я группа, n=9 | p |
| Катепсин К, пмоль/л | M±m | 4,7±0,4 | 11,4±0,6 | 20,7±1,2 | p1—2, 1—3, 2—3<0,001 pмн<0,001 |
| Me | 4,5 | 11,8 | 20,1 | ||
| [25; 75] | [3,8; 5,4] | [6,7; 14,3] | [17,3; 24,7] | ||
| TRACP5b, ед/л | M±m | 5,9±0,7 | 11,7±0,7 | 29,9±1,1 | р1—2, 1—3, 2—3<0,001 pмн<0,001 |
| Me | 5,6 | 11,6 | 30,3 | ||
| [25; 75] | [4,3; 6,7] | [8,6; 14,4] | [23,4; 35,2] | ||
| Активность костной щелочной фосфатазы, мкмоль/л | M±m | 9,6±0,8 | 14,3±0,5 | 87,8±1,9 | p1—2, 1—3, 2—3<0,001 pмн<0,001 |
| Me | 9,5 | 14,7 | 91,4 | ||
| [25; 75] | [7,8; 11,4] | [10,3; 18,5] | [80,2; 98,4] |
Примечание. Me — медиана; [25—75] — межквартильный диапазон. При дисперсионном анализе использовали критерий Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни, поправочный коэффициент на число сравниваемых пар Бонферрони. рмн — для сравнения всех групп.
Кратность увеличения концентрации остеомаркеров в содержимом периимплантационной борозды и в десневой жидкости в клинических группах по сравнению с контрольной группой.
* — статистически значимые отличия при p<0,05. КЩФ — костная фракция щелочной фосфатазы.
Относительно сходное различие было установлено и для концентрации ТРКФ. В экссудате периимплантационной зоны концентрация ТРКФ в 1-й группе (5,9±0,7 ед/л) была в 1,6 раза (p<0,05) выше, чем контрольное значение (3,7±0,5 ед/л), во 2-й группе в десневой жидкости превышения маркера остеорезорбции составило 3,2 раза (11,7±0,7 ед/л) и в 3-й группе — 8,4 раза (29,9±1,1 ед/л; см. рисунок).
Таким образом, определение маркеров остеорезорбции катепсина К и ТРКФ в локальной области позволило дать оценку изменения метаболизма костной ткани при различной стоматологической патологии, остеодеструкции различного генеза. В исследовании было установлено, что катепсин К и ТРКФ в значительной мере накапливались в десневой жидкости при метастатическом поражении челюсти, а также при злокачественном образовании слизистой оболочки полости рта с поражением костного субстрата. При воспалительно-деструктивных процессах у пациентов с периимплантитом маркеры остеорезорбции накапливались локально — в периимплантационной области, при этом их концентрация повышалась не более чем в 3 раза по сравнению с контрольными значениями.
Резорбция кости в норме находится в равновесии с процессами остеогенеза, осуществляемыми остеобластами [13]. Механизмы дифференцировки остеобластов изучены недостаточно [4]. Однако известно, что молодые клетки синтезируют главным образом КЩФ, в то время как зрелые клетки синтезируют остеокальцин и осуществляют процессы кальцификации, превращаясь в остеоциты [2, 14]. В содержимом периимплантационной зоны в клинических группах до лечения активность КЩФ по сравнению с контролем (4,2±0,6 мкмоль/л) была в 1-й группе (9,6±0,8 мкмоль/л) выше в 2,3 раза (p<0,05), во 2-й группе — в 3,6 раза (p<0,05), а в 3-й группе — в 22,3 раза (87,8±1,9 мкмоль/л) (см. таблицу). Таким образом, в 1-й и 2-й группах наблюдалось умеренное усиление продукции активированными остеобластами КЩФ.
На протяжении всей жизни человека происходит постоянное ремоделирование костной ткани, важную роль в этом процессе играют активность остеокластов, резорбирующих костную ткань, и остеобластов, способствующих ее формированию [15, 16]. В процессе метастазирования опухоли по кровеносным сосудам опухолевые клетки проникают в костную ткань. В формировании костного метастаза определяющими являются колонизация опухолевых клеток в кости, их влияние на клетки костного мозга с последующим «вытеснением» остеоцитов, нарушение взаимоотношений между остеокластами и остеобластами с последующим «разобщением» их работы под действием веществ, секретируемых опухолевыми клетками (факторов роста, интерлейкинов, цитокинов, гормонов) [17, 18]. Активация остеокластов приводит к разрушению структуры кости (остеолизу). Напротив, активация остеобластов приводит к патологическому костному образованию. При смешанных метастазах наблюдается активация клеток обоих типов — как остеокластов, так и остеобластов. Десятикратное превышение в биологических жидкостях полости рта концентрации маркеров остеорезорбции катепсина К и ТРКФ наряду с 20-кратным усилением активности изучаемого маркера костеобразования КЩФ свидетельствовало о смешанном характере перестройки костной структуры при метастазах у больных аденокарциномой больших слюнных желез. Определение концентрации остеоспецифических ферментов и установление многократного роста их концентрации позволяет своевременно диагностировать метастатическое поражение костей. Около 10% метастазов, выявленных радиоизотопным методом, не имеют рентгенологических признаков, т.е. являются рентгенонегативными. Дополнительную информацию дает определение костных маркеров в биологических жидкостях. Многократный рост концентрации маркеров активности остеокластов (катепсина К и ТРКФ), остеобластов (КЩФ) может свидетельствовать о возможном метастатическом поражении кости и необходимости применения лучевых и радиоизотопных методов для диагностики злокачественного опухолевого заболевания.
Биохимические маркеры являются чувствительными индикаторами ремоделирования костной ткани как при локальных воспалительно-деструктивных процессах при периимплантите, так и при первичном, а также метастатическом опухолевом поражении челюстей. Оценка маркеров метаболизма костной ткани в биологических жидкостях может использоваться как при диагностике, так и в последующем при лечении остеомодифицирующими лекарственными средствами.
Выводы
1. При периимплантите для контроля выраженности остеорезорбции рекомендуется определять концентрацию катепсина К и тартратрезистентной кислой фосфатазы в экссудате периимплантационной области.
2. При раке слизистой оболочки дна полости рта 10-кратный прирост концентрации катепсина К и тартратрезистентной кислой фосфатазы в десневой жидкости сопряжен с распространением опухолевого процесса на костную ткань.
3. При метастатическом поражении челюсти у больных аденокарциномой больших слюнных желез наряду с многократным повышением концентрации катепсина К и тартратрезистентной кислой фосфатазы в десневой жидкости наблюдается 20-кратное увеличение концентрации маркера костеобразования костной фракции щелочной фосфатазы, что свидетельствует о смешанном типе метастазов и служит дифференциально-диагностическим критерием метастатического поражения костной ткани челюсти по сравнению с первичным поражением кости опухолью.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — О.А. Зорина, М.А. Амхадова
Сбор и обработка материала — О.А. Борискина, Э.Ш. Алескеров, И.С. Костоев
Написание текста — О.А. Зорина, М.А. Амхадова, О.А. Борискина, Э.Ш. Алескеров, И.С. Костоев
Редактирование — О.А. Зорина, М.А. Амхадова
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept and design of the study — O.A. Zorina, M.A. Amkhadova
Data collection and processing — O.A. Boriskina, E.Sh. Aleskerov, I.S. Kostoev
Text writing — O.A. Zorina, M.A. Amkhadova, O.A. Boriskina, E.Sh. Aleskerov, I.S. Kostoev
Editing — O.A. Zorina, M.A. Amkhadova
The authors declare no conflict of interests.