Коллагеновые гидрогели как средство доставки факторов роста

Гидрогель — гидрофильная полимерная сетчатая структура, которая способна абсорбировать воду от 10—20 до 100% от своей сухой массы. Это свойство гидрогелей способствует проникновению, адгезии, пролиферации и дифференцировке в них клеток. Гидрогели обладают высокой биосовместимостью с минимальной воспалительной реакцией тканей, а также в случае их инъекционного введения, минимизируется инвазивность процедуры [21]. Коллагеновый гидрогель способствует инкапсуляции клеток, так как набухает в водной среде, благодаря высокому содержанию воды ускоряет транспорт и диффузию биоактивных веществ в ткани, а также хорошо подвергается ферментативной деградации [22]. Коллаген в структуре гидрогеля имеет несколько сайтов связывания белков внеклеточного матрикса, а также белков-индукторов остеогенной дифференцировки клеток [29].

Среди белков-остеоиндукторов важную роль играют костные морфогенетические белки (ВMPs), которые являются членами суперсемейства трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) и обладают выраженными остеоиндуктивными свойствами. Наибольшим остеоиндуктивным потенциалом обладают BMP-2, -4, -6, -7 и -9 [29]. Впервые данные белки были обнаружены в деминерализованных лиофилизированных костных матриксах, которые при имплантации в мышцы кроликов приводили к гетеротопическому неоостеогенезу [49]. BMP-2 зарекомендовал себя как наиболее эффективный и безопасный индуктор остеогенеза в многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях и в 2007 г. был рекомендован FDA к применению в клинике для проведения спондилодеза, синус-лифтинга, а также для постэкстракционного неоостеогенеза [46].

Помимо костных морфогенетических белков, на индукцию остеогенной дифференцировки клеток оказывает влияние и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который включает в себя семейство биологически активных белков, ауто- и паракринно регулирующих васкуло-, ангио- (VEGF-A, B; PIGF) и лимфогенез (VEGF-C, D). Эти белки были впервые обнаружены в 1971 г. при изучении опухолевого ангиогенеза [50], они продуцируются во множестве тканей организма. Ангиогенез является неотъемлемой частью остеогистогенеза, поэтому VEGF можно считать непрямым индуктором остеогенной дифференцировки клеток. Кроме того, были обнаружены непосредственное влияние VEGF на пролиферацию клеток — предшественниц костной ткани (она возрастает до 70%) [51], а также продукция VEGF клетками остеобластического дифферона [52].

Еще одним важным регулятором остеогенеза является фактор стромальных клеток (SDF) — белок, который относится к группе хемокинов и представлен двумя формами (SDF-1α и SDF-1β) [53]. Остеобласты в зоне дефекта костной ткани продуцируют SDF-1, который стимулирует миграцию малодифференцированных клеток (ММСК) в область повреждения, однако ингибирует их дифференцировку в клетки остеобластического дифферона [54]. При воспалении снижается активность BMP, поэтому возрастает продукция SDF-1 остеобластами с целью привлечения в область костного дефекта дополнительных камбиальных резервов и эндотелиальных клеток-предшественниц. С наступлением периода регенерации возрастает активность BMP-2 и BMP-7, которые подавляют продукцию остеобластами SDF-1, ингибирующего дифференцировку мигрировавших клеток в остеобластическом направлении. На этапе ремоделирования костного регенерата вновь снижается активность BMP и возрастает продукция SDF-1 с целью привлечения в губчатое вещество регенерата гемопоэтических стволовых клеток для осуществления неоангиогенеза [55].

Одной из перспективных разработок генной инженерии является заключение гена, кодирующего белок — фактор роста, в систему его внутриклеточной доставки (вектор). По происхождению векторы подразделяются на вирусные (ретро-, ленти-, аденовирусы и др.) и невирусные (кольцевая или линейная плазмида). По эффективности трансфекции гена вирусные векторы обладают преимуществом, так как в клетки-мишени поступает 40% и более генных конструкций, в то время как из плазмиды — всего 1—2% [56]. Вирусный вектор, в отличие от плазмидного, способен встраиваться и геном клеток-мишеней и обеспечивать длительную экспрессию трансгена. Длительность продукции белка — фактора роста не должна превышать сроки репаративной регенерации, поэтому вирусные векторы предпочтительно использовать для культуры клеток ex vivo с последующим соединением культуры с матриксом остеопластического материала [57]. Про риски применения: При встраивании можно случайно попасть под промотор онкогена… Без встраивания безопаснее, хоть и не будет длительной экспрессии.

Основная задача коллагеновых гидрогелей с импрегнированными остеоиндукторами заключается в необходимости контролируемого и пролонгированного высвобождения последних с целью воспроизведения моделей регенерации, имитирующих процессы естественного морфогенеза костной ткани. Скорость высвобождения индукторов остеогенеза определяется тем, как они связаны с гидрогелем. Индукторы можно смешивать с носителем, инкапсулировать в нем, химически иммобилизовывать путем формирования ковалентных или аффинных связей. Инкапсуляция остеоиндукторов в гидрогеле может быть достигнута использованием полимерных микрочастиц (1—100 мкм) с различной площадью поверхности, через которые инкапсулированный фактор роста диффундирует со скоростью, зависящей от размера частиц носителя [40, 41]. К недавним разработкам в этой области относится метод инкапсуляции BMP-2 в микросферы из рекомбинантного белка на основе человеческого коллагена I типа (RCP). Наблюдалось двухфазное высвобождение BMP-2, при котором большая его часть сохранялась в микросферах в течение 2 нед. Также на кинетику высвобождения BMP-2 из коллагеновых микросфер оказывали влияние сшивка и размер микросфер. Так, увеличение степени химической сшивки (гексаметилендиизоцианидом) снизило объем первичного выброса BMP-2 (в течение 1-х суток) с 23 до 17%. Сшивка микросфер дегидротермическим методом уменьшила первичный выброс до 11%. Также уменьшение размера микросфер с 207 до 50 мкм значительно снизило первичный выброс BMP-2. При этом BMP-2 оставался биологически активным [45]. Еще один способ доставки аффинно связанного с гидрогелем остеоиндуктора BMP-2 основан на конкурентном вытеснении его фибронектином плазмы крови в костном регенерате. Таким образом, происходит постепенное и медленное высвобождение фактора роста из гидрогеля с достижением пика концентрации BMP-2 на 5—7-е сутки после имплантации, к началу периода дифференцировки клеток [15]. Гепарин как компонент внеклеточного матрикса имеет в структуре своей молекулы домены, которые образуют стабильные комплексы с BMP-2. Поэтому гепарин часто применяют для иммобилизации данного остеоиндуктора и пролонгированной доставки его для регенерации костной ткани [43]. Однако гепарин обладает рядом свойств (нестабильность структуры, антикоагулянтное действие), которые не позволяют ему стать идеальным иммобилизатором остеоиндуктора в гидрогеле [44]. С целью стабилизации BMP-2 в гидрогеле и контролируемого высвобождения остеоиндуктора недавно была разработана гепаринимитирующая поверхность фотополимеризуемого гидрогеля, которая состоит из сульфированных молекул, таких как поливинилсульфоновая кислота (PVSA) или поли-4-стиролсульфоновая кислота (PSS). Биоактивность BMP-2 в присутствии полисульфонатов не снижалась, несмотря на неблагоприятные воздействия среды, такие как нестабильность молекулы и ферментативная деградация белка-остеоиндуктора [42]. Механизмы доставки индукторов остеогенеза важны для будущих клинических исследований, так как с их помощью достигаются контролируемое пространственно-временное высвобождение факторов роста и поддержание их оптимальной концентрации для обеспечения процесса регенерации костной ткани.