Несмотря на развитие травматологии и ортопедии, полное восстановление костной ткани является проблемным, поскольку большие дефекты не могут заживать спонтанно. Использование стволовых клеток - все более расширяющаяся область исследования, дающая надежду на успех терапевтических методов лечения ран и травм, на которые невозможно эффективно воздействовать современными хирургическими методами [5, 7].

Красный костный мозг содержит прогениторные клетки (плюрипотентные стромальные - ПСК), способные к дифференцировке в костную, хрящевую и другие виды соединительной ткани. Это позволяет широко применять такие клетки для ускорения регенерации костей [1, 5].

В научной литературе имеется множество данных об эффективности использования клеточных технологий в стоматологии, травматологии и хирургии. Однако полностью отсутствуют результаты исследования лимфатических узлов после указанных способов воздействия на регенерацию костной ткани, тогда как именно эти органы являются маркером выраженности местного воспалительного процесса, по изменениям в них можно точно оценивать результативность тех или иных лечебных мероприятий, предсказывать развитие многих осложнений, а значит, и успешно принимать меры по их профилактике.

В связи с вышеизложенным цель исследования - изучение реакций регионарных лимфатических узлов, обусловленных имплантацией аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения (АММСККП) для ускорения регенерации дефекта кости нижней челюсти в эксперименте.

Работа основана на результатах морфологического исследования особенностей изменения структурной организации субмандибулярных лимфатических узлов крыс-самцов инбредной линии Wag в разные сроки при введении в искусственно созданный дефект кости угла нижней челюсти АММСККП, адсорбированных на матрице из полигидроксиалканоата (ПГА).

Эксперименты проводили на самцах крыс инбредной линии Wag весом 180-200 г возрастом 6 мес. Все манипуляции с животными осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР №755 от 12 августа 1977 г.; Приказ Министерства высшего и среднего специального образования СССР №742 от 13 ноября 1984 г.). На каждую точку исследования было использовано не менее 6 крыс (от 6 до 12 особей, всего 62 животных).

АММСККП выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных костей у крыс-самцов линии Wag. Полученную суспензию клеток помещали в пластиковые флаконы («Nunk», Дания), через 48 ч после эксплантации костного мозга неприкрепившиеся клетки сливали. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде α-МЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Biolot», Россия) при 37 °С в СО2 инкубаторе с 5% СО2 в условиях насыщенной влажности. Смену среды производили каждые три дня. При субкультивировании монослойную культуру рассевали в плотности 1000-5000 клеток/см² (в зависимости от ростовых свойств используемой эмбриональной сыворотки), использовали стандартные растворы Версена и трипсина. Физические, морфологические, фенотипические признаки и дифференцировочный потенциал полученных клеток соответствовали таковым для АММСККП, которые были определены и описаны нами ранее [3, 4].

АММСККП 2 пассажа, полученные от крысы указанной линии, трансфицировали ДНК плазмиды pЕGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., USA), содержащей ген зеленого флюоресцентного белка GFP под контролем промотора цитомегаловируса и ген устойчивости к неомицину под контролем промотора вируса SV40, необходимого для последующей селекции с использованием дженетицина G418 (pEGFP-N1; «Clontech Laboratories Inc.», USA). Подробный протокол трансфекции и способы оценки экспрессии введенного гена GFP в АММСККП изложены в наших более ранних работах [4].

ПГА (сополимер из 85% полигидроксибутирата и 15% гидроксивалериата) в виде матриксов холодного прессования (авторское название) диаметром и высотой 2 мм был предоставлен для исследования Институтом биофизики СО РАН (Красноярск). Полимер до адсорбции АММСККП стерилизовали замоченными в забуференном физиологическом растворе для культур клеток в автоклаве при 120 °С, давлении в 1 атмосферу в течение 20 мин. Непосредственно перед внедрением приготовленный для имплантации фрагмент ПГА для пассивной адсорбции клеток погружали в суспензию АММСККП в культуральной среде (1·10⁶ клеток в 1 мл суспензии) на 2 ч, в связи с тем, что живые клетки прикрепляются к любому твердому субстрату.

Модель дефекта костной ткани в эксперименте: под общим ингаляционным эфирным наркозом, в условиях чистой операционной, при соблюдении правил асептики и антисептики, после обработки кожи спиртом скальпелем производили разрез кожи длиной 1,5-2 см по нижнему краю нижней челюсти. Тупым способом при помощи распатора отслаивали жевательную мышцу и обнажали поверхность кости нижней челюсти в области ее угла. Стоматологическим бором делали круглое отверстие диаметром 2 мм в кости угла нижней челюсти, с полостью рта дефект кости не сообщался. После внедрения ПГА с адсорбированными АММСККП или без клеток (контроль) послойно ушивали рану викрилом. Животные с признаками гнойно-воспалительных осложнений (абсцессы в подкожной клетчатке) из эксперимента выбраковывались и в дальнейших исследованиях не участвовали.

Спустя 1, 2, 3, 4 и 5 нед после операции субмандибулярные (регионарные к месту применения АММСККП) лимфатические узлы фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Неокрашенные срезы толщиной 5-7 мкм изучали на световом микроскопе Axioimager M1 («Carl Zeiss», Германия) при увеличении до 1200 раз в режиме люминесценции с фильтром Alexa 488.

Процессы репарации искусственно созданного дефекта костной ткани в области угла нижней челюсти крыс как без какого-либо воздействия, так и на фоне имплантации ПГА без АММСККП описаны нами ранее [2, 3].

Статистически достоверные отличия между состоянием центров размножения субмандибулярных лимфатических узлов после имплантации в участок повреждения кости нижней челюсти чистого ПГА или ПГА с АММСККП не найдены.

Вместе с этим через 1 нед после имплантации ПГА с адсорбированными АММСККП в дефект нижнечелюстной кости в регионарных (субмандибулярных) лимфатических узлах при исследовании в отраженном ультрафиолетовом свете были найдены овальные скопления ярко светящихся клеток. Эти клетки были очень крупными, до 20 мкм в диаметре, и такие клетки располагались в лимфоидных узелках. Во флюоресцирующих клетках светилась не вся цитоплазма, а разные по размерам овальные гранулы, т.е. клетка представляла собой скопление ярко светящихся частиц с четкими ровными краями. Размер этих гранул достигал 10 мкм. Иногда было видно темное овальное ядро (рис. 1, а, б, см. на цв. вклейке).

Спустя 2 нед после применения ПГА с АММСККП для воздействия на репарацию поврежденной нижней челюсти в лимфатических узлах количество крупных специфически светящихся клеток увеличилось. Причем увеличилось как число овальных скоплений таких объектов, так и число клеток в них. По-прежнему в таких клетках светилась не вся цитоплазма, а множество различных по размерам гранул (см. рис. 1, в, г, на цв. вклейке).

К следующему сроку применения, к 3-й неделе, площадь скоплений крупных светящихся клеток значительно уменьшилась, также сократилось и количество клеточных элементов в них. Но вместе с этим резко возросло число флюоресцирующих клеток, расположенных поодиночке в структурах лимфатических узлов (см. рис. 1, д, е на цв. вклейке).

Этот процесс сокращения размеров скоплений светящихся клеток и числа самих объектов со свечением в них прогрессировал и на 4-й и 5-й неделях. К этому времени можно отметить не равномерное расположение крупных светящихся клеток в лимфоидных узелках, а выстраивание таких объектов по периферии узелков. Также следует обратить внимание на постепенное уменьшение количества светящихся гранул в указанных крупных клетках (см. рис. 1, ж, з на цв. вклейке).

На рисунках с большим увеличением (см. рис. 1, б, г, е-з на цв. вклейке) четко видно, что ткань овальных скоплений светящихся клеток отличается по плотности и фоновой окраске от окружающих тканей и имеет четкую границу. Это дает возможность для предположения о концентрации клеток со светящейся цитоплазмой в лимфоидных узелках.

Кроме этого, на некоторых из указанных рисунков (см. рис. 1, г, е-з на цв. вклейке) хорошо видна флюоресценция эритроцитов в сосудах, проходящих рядом со скоплением крупных светящихся клеток и внутри его. Эритроциты, согласно литературным данным, обладают аутофлюоресценцией [10].

В лимфатических узлах животных после применения ПГА без АММСККП светящиеся объекты отсутствовали как в лимфоидных узелках, так и в других структурах данных органов (рис. 2, а-е, см. на цв. вклейке).

В течение 5 нед после имплантации ПГА с адсорбированными АММСККП с трансфицированным геном GFP в дефект кости нижней челюсти в субмандибулярных лимфатических узлах присутствовали овальные скопления ярко светящихся клеток. Эти клетки были очень крупными, до 20 мкм в диаметре (см. рис. 1, а-з на цв. вклейке).

Такие клетки с флюоресценцией располагались в лимфоидных узелках, в пользу чего свидетельствует то, что на некоторых препаратах четко видны различия в плотности тканей между скоплениями светящихся клеток и вокруг них (см. рис. 1, б, г, е-з на цв. вклейке) и то, что такие скопления имеют шаровидную форму и расположены только в корковом веществе недалеко от капсулы, т.е. в корковом плато, а не в паракортексе и не среди мозговых синусов в мякотных тяжах.

Скорее всего светящиеся клетки в лимфатических узлах являются макрофагами. Такое заключение сделано на основании нескольких причин:

1. Размер клеток. Только очень немногие клетки могут превышать по размеру 20 мкм, и среди таких клеточных элементов - макрофаги.

2. Наличие множества разнокалиберных включений, которые, скорее всего, являются лизосомами.

3. Неправильная форма клеток.

4. Расположение в лимфатических узлах. В лимфатических узлах макрофагов очень много в герминативных центрах лимфоидных узелков, куда они представляют антигены для осуществления иммунных функций и где они фагоцитируют и лизируют клетки с признаками деструктивных изменений, множество которых образуется при делении и дифференцировке В-лимфоцитов.

В таком случае светящиеся разнокалиберные гранулы в макрофагах являются лизосомами с поглощенным флюоресцентным материалом.

Необходимо отметить, что имеется множество данных об аутофлюоресценции макрофагов в некоторых условиях [6]. Но в таком случае должна быть точно такая флюоресценция макрофагов в лимфатических узлах животных после применения ПГА без АММСККП. Однако в данном случае в лимфатических узлах светятся только небольшие клетки (эритроциты), а скопления крупных светящихся объектов полностью отсутствуют (см. рис. 2, а-е на цв. вклейке).

Можно сделать предположение, что такие крупные светящиеся клетки в лимфатических узлах являются не просто макрофагами, а макрофагами, которые фагоцитировали введенные АММСККП или структуры, сформированные из таких клеток. В научной литературе имеются результаты исследований, указывающие на возможность флюоресценции макрофагов за счет свечения фагоцитированного и метаболизированного материала в их гранулах [8].

В месте повреждения кости нижней челюсти с последующей имплантацией ПГА с адсорбированными АММСККП развивается асептическая воспалительная реакция, характеризующаяся поступлением в регионарные лимфатические узлы, в данном случае - субмандибулярные, большого объема клеточного и тканевого детрита, который поглощается макрофагами.

Несомненно, что вместе с этим детритом в лимфатические узлы поступает и часть введенных АММСККП.

В узлах макрофаги поглощают антигенный материал и, видимо, попавшие туда фрагменты АММСККП вместе со светящимся белком GFP. В таких случаях лизосомы макрофагов, в которых находится флюоресцентный белок, могут светиться в отраженном свете так же, как и сами АММСККП с трансфицированным геном GFP. Также не исключено и встраивание ДНК белка GFP в геном макрофагов и наработка этого белка, но такая возможность кажется маловероятной.

То, что макрофаги с поглощенным клеточным светящимся детритом сконцентрированы в лимфатических узлах в герминативных центрах узелков, можно объяснить с 2 позиций.

Во-первых, в герминативных центрах идут размножение, активация и дифференцировка клеток В-линии, которые в дальнейшем будут синтезировать антитела против определенных антигенов. Для запуска и успешного осуществления этого процесса необходимо присутствие макрофагов с данным антигеном. В самих центрах размножения имеется множество макрофагов, которые могут поглощать антигены из окружающих тканей и, видимо, лимфы, проходящей по промежуточным синусам.

Во-вторых, макрофаги могут фагоцитировать светящиеся клетки или вышедший из них при разрушении белок GFP из лимфы и затем или мигрировать в узелки для активации и запуска процесса пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов или передавать антигены другим макрофагам, находящимся уже непосредственно в лимфоидных узелках. Существует возможность фагоцитирования АММСККП и их детрита в месте имплантации ПГА, миграции макрофагов с антигеном в лимфатические узлы вместе с током лимфы и уже в этих органах миграции или передачи антигенов фагоцитам центров размножения.

Таким образом, не исключено создание иммунной защиты против введенных АММСККП с трансфицированным геном GFP или самого светящегося белка. Не исключено, что после повторного введения клеток с трансфицированным геном GFP такие клеточные элементы будут очень быстро уничтожаться системой иммунитета и из них не будет формироваться никаких структур.

Необходимо рассмотреть еще одну возможную причину свечения макрофагов. Известно, что эритроциты обладают выраженной аутофлюоресценцией [10]. При моделировании повреждения кости нижней челюсти повреждаются многочисленные кровеносные сосуды и эритроциты оказываются в тканях.

В месте геморрагий клетки крови поглощаются макрофагами (сидерофагами), кроме того, эритроциты из тканей поступают в регионарные лимфатические узлы, где также фагоцитируются макрофагами. Такое присутствие эритроцитов и продуктов их распада в лизосомах макрофагов может обусловить их флюоресценцию под воздействием ультрафиолетового облучения. В литературе есть данные, описывающие флюоресценцию макрофагов вследствие наличия в них гемосидерина [9].

Однако при повреждении кости нижней челюсти и имплантации ПГА без АММСККП в тканях также оказывается множество эритроцитов, которые затем также фагоцитируются макрофагами и попадают в лимфатические узлы. Но при исследовании лимфатических узлов животных этой группы скопления светящихся макрофагов в лимфоидных узелках не были обнаружены.

Количество крупных светящихся клеток увеличивалось до 2-й недели, причем увеличилось как число овальных скоплений таких объектов, так и содержание клеток в них. По-прежнему в таких клетках светилась не вся цитоплазма, а множество различных по размерам гранул (см. рис. 1, а-г на цв. вклейке).

Начиная с 3-й недели содержание светящихся клеточных элементов начало снижаться. На 4-5-й неделях в лимфоидных узелках присутствовали только единичные клетки со свечением, которые были выстроены по периферии узелков. К окончанию времени наблюдения также можно отметить постепенное уменьшение количества светящихся гранул в таких макрофагах (см. рис. 1, д-з на цв. вклейке).

Постепенно введенные АММСККП замещаются собственными клетками и структурами. Вследствие того, что структур, построенных из имплантированных АММСККП, становится все меньше, в лимфатических узлах сокращается количество светящихся макрофагов, содержание светящихся гранул в них и интенсивность свечения.

После внедрения в участок повреждения кости нижней челюсти ПГА с адсорбированными АММСККП с трансфицированным геном GFP в лимфоидных узелках регионарных лимфатических узлов появляются многочисленные крупные макрофаги с множеством овальных светящихся включений в цитоплазме. Численность таких макрофагов нарастает в течение 2 нед после операции, а далее начинает уменьшаться. Видимо, введенные таким способом АММСККП частично поглощаются макрофагами. При разрушении структур, сформированных из АММСККП, детрит также фагоцитируется макрофагами. В том и другом случае эти макрофаги оказываются в герминативных центрах лимфоидных узелков лимфатических узлов, где не исключена инициация иммунитета против ДНК и белка GFP.