Восстановление поврежденных тканей организма биосовместимыми материалами - актуальная проблема современной медицины. Перспективными материалами для остеопластики могут быть многофункциональные биополимерные матриксы на основе хитозана (ХТЗ), альгината (АЛГ) и фибрина в сочетании с кальций-фосфатной керамикой.

ХТЗ получают из хитина - второго по распространенности биополимера после целлюлозы - в реакциях деполимеризации и деацетилирования при щелочном гидролизе либо с помощью гидролитических ферментов хитиназы и деацетилазы из панциря ракообразных [1]. Хитин является биополимером, состоящим преимущественно из остатков N-ацетилглюкозамина и меньшего количества N-глюкозамина (рис. 1).

ХТЗ используют как биосовместимое, биорезорбируемое и биоадгезивное соединение [7, 21, 35] в медицинских и фармацевтических целях, в том числе в разных имплантационных и инъекционных системах, в ортопедических и пародонтальных композитах [37], при обработке ран, регенерации мягких и твердых тканей [22], как биореактивный гемостатический агент с антитромбогенными свойствами [21, 36, 37] и как стимулятор иммунной системы хозяина против вирусной и бактериальной инфекции [1]. В результате биодеградации ХТЗ высвобождаются аминосахара, которые могут включаться в обменные превращения гликозаминогликанов и гликопротеинов и затем экскретироваться [13]. ХТЗ может выполнять специфические клеточные функции, индуцируя цитокины, благоприятно влияющие на гистоархитектонику соединительной ткани, улучшать остеогенез, ангиогенную активность, состояние тканей суставных хрящей [28, 34], кожных регенератов. Матриксы из ХТЗ (губки) с наполнителями из гидроксиапатита (ГА) могут применяться для регенерации костной ткани [2, 3]. Один из недостатков ХТЗ - присутствие в его составе некоторого количества недеацетилированного хитина, что снижает его остеопластические свойства и повышает долю соединительнотканной компоненты.

АЛГ - безазотистые полисахариды; с молекулярной точки зрения они представляют собой семейство неразветвленных бинарных сополимеров, состоящих из связанных [1-4]-гликозидными связями остатков бета-D-мануровой (М) кислоты или ее С-5-эпимера альфа-L-гулуроновой кислоты (G), образующих длинные цепи (рис. 2).

Коммерческие АЛГ производятся в основном из водорослей Laminaria hyperborea, Macrocystis pyrifera и Ascophyllum nodosum. Наиболее высокое содержание α-D-гиалуроновой кислоты обычно характерно для АЛГ, изготовленных из полосок старых растений L. hyperborea. АЛГ из A. nodosum и L. japónica отличаются низким содержанием G-блоков и невысокой прочностью геля. Альгинат из М. pyrifera, чаще всего используемый для иммобилизации, образует гели меньшей прочности и стабильности, чем АЛГ, изготавливаемый из полосок L. hyperborea. Бактериальный АЛГ, имеющий более сложный состав, можно выделить из Azotobacter vinelandii, который, в отличие от вида Pseudomonas, образует полимеры, содержащие G-блоки. АЛГ с высоким содержанием гулуроновой кислоты можно также получить из некоторых водорослевых тканей путем химического фракционирования in vitro с использованием маннуроновой С-5-эпимеразы из A. vinelandii. Коммерческого использования таких модифицированных видов полимеров мы не выявили.

АЛГ используется как материал для получения зубных слепков [4, 6]. Он обладает биосовместимостью, неиммуногенностью и гидрофильностью [32]. Химически модифицированный АЛГ применяется в клинике в качестве матрикса для доставки лекарственных веществ и клеток в поврежденные участки [10, 11]. К недостаткам этого материала можно отнести то, что он не резорбируется естественным образом под действием ферментов, так как не имеет лиганд для клеточной адгезии, и поэтому клетки не склонны естественным образом АЛГ связываться с АЛГ [33]. При модификации АЛГ RGD-пептидами к нему могут прикрепляться клетки типа миобластов. Меняя концентрацию RGD-пептидов и состав АЛГ, т.е. соотношение M/G, можно управлять фенотипом миобластов [30]. АЛГ с ионной перекрестной связью растворяются при нейтральном рН, утратив 2-валентные катионы перекрестной связи, что приводит к неконтролируемому и медленному распаду in vivo [10, 11].

Фибрин существенно отличается от полисахаридов по происхождению и составу. Он представляет собой последний этап коагуляционного каскада за счет активации фибриногена тромбином. В результате от фибриногена отщепляются 2 пептида А и 2 пептида Б (рис. 3, а, б)

Фибрин может связываться с биологическими тканями посредством ковалентных водородных или электростатических связей либо путем механического прикрепления [31]. Он образует ковалентные связи с фибронектином и коллагеном с помощью фактора XIIIa, а также может связываться с тромбоцитами, мегакриоцитами и фибробластами через комплекс рецептора GPIIb/IIIa, прикрепляясь таким образом сгустком к коллагену. Продукты распада фибрина, образующиеся в результате протеолитического расщепления, стимулируют миграцию моноцитов, которые далее трансформируются в макрофаги, удаляя разложившийся фибрин посредством фагоцитоза. Стимулированные фибробласты, мигрирующие в фибриновую сеть, депонируют коллаген и выделяют активаторы плазминогена, способствуя лизису фибрина и тем самым активируя реваскуляризацию тканей. В настоящее время существуют 2 формы практического применения фибрина в тканевой инженерии. Это - адгезивный фибрин-силант (герметик) и непористый фибрин-гидрогель, который обычно используется для стимуляции клеточного роста поврежденных хрящей [12, 27] и кости [16, 20]. Фибриновые силанты (герметики или фибриновый тканевый клей) нашли широкое применение при хирургических операциях в стоматологии [5, 16] для склеивания тканей, как кровоостанавливающие вещества и герметизирующие матрицы роста [9, 15, 19, 23, 25, 26, 29].

L. Le Guehennec и соавт. (2004) приводят данные о положительном и отрицательном влиянии взаимодействия фибринового силанта с кальций-фосфатной керамикой на процессы формирования костной ткани.

В данной работе проведено сравнительное экспериментально-морфологическое исследование биополимеров ХТЗ, АЛГ и фибрина в комплексе с кальций-фосфатной керамикой β-трикальцийфосфата (β-ТКФ). Разработана единая методика получения полимерных матриксов, содержащих гранулы β-ТКФ. Проведена оценка остеопластических свойств при замещении дефектов костной ткани in vivo.

Для получения композиционных материалов использовали технологию вспенивания с последующей сублимационной сушкой. Данная технология позволяет получить материал с высокой пористостью (до 98%) и взаимосвязанными порами. В качестве биополимеров использовали высокомолекулярный (500 кДа) ХТЗ, АЛГ натрия и фибриноген. Готовили 2% водную суспензию полимера. В суспензию вводили гранулы β-ТКФ в количестве до 20 масс.% и подвергали интенсивному перемешиванию. Гранулы β-ТКФ получали методом, описанным в работе V. Komlev и соавт. [17]. Размер гранул - 200-800 мкм. Вспенивание осуществляли при 2000 об/мин, используя приводную мешалку. Пену помещали в полиэтиленовую квадратную форму (10/10/4 мм) и фиксировали структуру (замораживали). Заморозку продолжали до образования кристаллов льда по всему объему материала при температуре –18 °С. Затем проводили сублимационную сушку материалов. Полученные матриксы отмывали и полимеризовали. Образцы сушили при температуре 50 °С до полного удаления жидкой фазы.

Материалы изучали на микроскопе Tescan Vega II (Чехословакия) при напряжении 10-15 кВ. Фазовый состав керамики контролировали с использованием рентгенофазового дифрактометра Shimadzu (Япония).

Остеопластические свойства полученных матриксов оценивали с помощью модели костного дефекта эпифиза бедренной кости крыс линии Вистар массой 230-250 г. Тестированию подвергали 3 материала. В экспериментальных исследованиях было сформировано 4 группы по 3 животных в каждой: 1-я (контрольная); дефект заживал под кровяным сгустком; во 2-й группе использовали матриксы из ХТЗ с наполнителем β-ТКФ; в 3-й - матриксы из АЛГ с наполнителем β-ТКФ; в 4-й - матриксы из фибрина с наполнителем β-ТКФ.

Оперативные вмешательства выполнены в области латерального мыщелка бедренной кости в зоне эпифиза. Под гексеналовым наркозом моделировали дырчатый дефект диаметром около 2,5 мм и длиной около 4 мм, в который вводили исследуемый материал. Операционную рану ушивали послойно. Срок эксперимента составлял 30 сут. После выведения животных из эксперимента выделяли макропрепараты. Образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине, декальцинировали в ЭДТА, промывали, обезвоживали, заливали в парафин и готовили серийные срезы. Окраску производили гематоксилином и эозином. Гистологические препараты изучали на микроскопе Motic (Италия). Статистическая обработка данных выполнялась с использованием апостериорного сравнения по критерию Тьюки.

Поверхность хитозанового композиционного материала была представлена губчатой, пористой структурой, содержащей гранулы β-ТКФ. Хитозановые волокна плотно соединены с фосфатами кальция (рис. 4, а).

Поверхность альгинатного композита выглядит как пористый матрикс, который неравномерно покрывает гранулы β-ТКФ (см. рис. 4, в).

Поверхность фибрин-матрикса представлена тонкой фибриновой пленкой, покрывающей гранулы (см. рис. 4, д).

Гранулы β-ТКФ состоят из зерен овальной или кубической формы с четко различимыми границами, между которыми можно наблюдать небольшие поры размером около 1 мкм (см. рис. 4, е, участок А). Гранулы равномерно распределены в полимерных матриксах.

Через 30 дней в костном дефекте сохранялись обширные области, занятые грубоволокнистой соединительной тканью. В то же время по краям костного дефекта отмечалось формирование новой трабекулярной костной ткани с фиброзным матриксом. Местами по краям регенерата имелись участки образований хондроподобной ткани, а также образования вновь формирующегося костного вещества с образованием костно-хрящевых структур (рис. 5, а, см. на цв. вклейке).

В гистологических препаратах в костном дефекте определялись депозиты имплантированного материала, содержащего скопления гранул β-ТКФ с оксифильно окрашенным матриксом и «волокнами» хитина. Последние выглядели как ветвистые образования из плотного оксифильного вещества. Хитиновые образования в матриксе распределялись неравномерно. У входа в костный дефект в матриксе ХТЗ их количество было незначительным, в глубоких отделах возрастало (см. рис. 5, б на цв. вклейке).

Хитозановый матрикс на всем протяжении замещался клеточно-волокнистой соединительной тканью, так что ячеисто-губчатый характер исчезал. Окружала имплантированный материал соединительнотканная капсула, прилежащая снаружи к костной ткани дефекта (см. рис. 5, б). Наличие капсулы и хитозановых волокон существенно препятствует формированию костных структур, что находит отражение в слабой капиллярной сети. Процессы резорбции гранул и образование костного матрикса слабо выражены, что снижает возможность его использования как остеопластического материала при заживлении костных дефектов.

В предыдущих исследованиях композита ХТЗ - карбонат ГА (ХТЗ:КГА) при заживлении костных дефектов процесс резорбции гранул КГА и формирование трабекулярной кости происходило более активно, чем при использовании β-ТКФ [2]. Отмечалось присутствие достаточно большого количества хитиновых образований и соединительнотканной компоненты вокруг них, что тормозило образование костных структур. Эти данные согласуются с результатами настоящего исследования. Как отмечает автор, со временем небольшие чешуйки хитина постепенно поглощаются новообразованной костной тканью и практически не подвергаются резорбции. Тем не менее несмотря на эти отрицательные свойства, ХТЗ используется при получении биорезорбируемых мембран для направленной тканевой регенерации [18].

У входа в костный дефект определяется альгинатный композит, содержащий гранулы β-ТКФ; он имеет оксифильный пористый вид и окружен соединительнотканной капсулой, по периферии прилежащей к костному матриксу. Ближе к центральным отделам дефекта губчатый характер альгинатного матрикса сохраняется, его ячейки инфильтрированы клетками фибробластического ряда.

В некоторых гранулах происходит инвазия клеточных элементов, но образование остеоидной ткани вокруг них идет крайне медленно. Это затрагивает и альгинатный матрикс, который со временем минерализуется. В других местах можно наблюдать плотные, мелкопористые структуры с небольшим количеством клеточных элементов (см. рис. 5, в на цв. вклейке)

В этот срок наблюдения гранулы β-ТКФ окружает фибриновый матрикс, представленный полями соединительной ткани с обилием капилляров (см. рис. 5, г на цв. вклейке).

Полученные нами результаты согласуются с данными C. Weinand и соавт. [39]. Авторы использовали гидрогели из фибрина и АЛГ, содержащие пористые блоки β-ТКФ, которые помещали в среду, содержащую мезенхимальные стволовые клетки. Через 4 нед на образцах из фибрина образовывались костные структуры, что подтверждалось экспрессией генов белка кости, сравнимой с таковой в нативной кости. АЛГ незначительно поддерживал образование костной ткани после 6 нед, а также демонстрировал низкий уровень транскрипции генов. Однако образцы с АЛГ характеризовались более высокими показателями сопротивления биомеханическому сжатию, чем у фибрина, что, возможно, связано с большой длительностью распада АЛГ [38].

Таким образом, изучение композиционных материалов с помощью СЭМ показало, что происхождение материала и его состав существенно влияют на микроструктуру.

Композиционные материалы на основе ХТЗ и АЛГ обладают биосовместимостью, биорезорбцией и могут стимулировать остеопластические процессы. Однако они резорбируются не до конца, а с сохранением характерных для них фрагментов. У ХТЗ - это хитин, который обнаруживается на гистопрепаратах, а у АЛГ - полифенолы и другие примеси. Хитозановый матрикс замещается в основном соединительной тканью со слабой резорбцией гранул β-ТКФ, слабовыраженными остеопластическими процессами и капиллярной сетью, но с большим количеством хитиновых волокон, которые и задерживают эти процессы.

Фибрин лишен указанных недостатков, так как является составной частью метаболизма ткани. При его резорбции продукты распада стимулируют образование макрофагов, фибробластов, капиллярной сети. Находясь в центре дефекта, гранулы β-ТКФ постепенно замещаются новообразованной костной тканью, т.е. наблюдаются преимущественно костные структуры и в меньшей степени - соединительнотканные.

Итак, согласно результатам исследования, композит фибрин: β-ТКФ является более перспективным материалом для целей остеопластики, чем композиты из ХТЗ и АЛГ, и в дальнейшем может быть рекомендован к широкому применению в челюстно-лицевой хирургии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант РФФИ 12-03-33074 мол_а_вед).