Для стоматологии проблема разработки биоинженерных конструкций, лечебное воздействие которых направлено на восстановление костных структур, особенно актуально, поскольку значительная доля структурной организации указанной анатомической области принадлежит костным образованиям [9].

В частности, для челюстно-лицевой хирургии в настоящее время актуально создание комплексных (гибридных) имплантатов, включающих в себя химически стабильную нерезорбируемую основу в качестве носителя клеток (стволовые клетки, остеогенные предшественники или остеобласты) [1, 2]. Так как применение стволовых клеток посредством инфузий, инъекций и других способов введения их взвеси в область деструкции оказалось малоэффективным [3, 5, 11], большинством разработчиков был избран метод применения активного клеточного материала на различных носителях с предварительным культивированием клеток [4, 6—8, 12]. При этом спектр носителей оказался чрезвычайно широким — от металлических до полимерных, в том числе — резорбируемых [4, 6, 8].

В настоящем сообщении представлена технология получения носителей для биоинженерных конструкций на основе пористого политетрафторэтилена (ПТФЭ) с наноструктурным модифицирующим покрытием, разработанным в МИСиС при участии ЦНИИСиЧЛХ как организации, апробирующей эффективность метода [10, 14]. Обсуждаются также перспективы и направления его применения.

Для изготовления гибридных биоинженерных конструкций в качестве подложек с наноструктурным покрытием использовали ПТФЭ с пористостью 36% (производство ЗАО НПК «Экофлон»). Для осаждения наноструктурного покрытия применяли композиционную мишень ТiC_0,5+Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, синтезированную по технологии силового СВС-компактирования на базе опытно-промышленного участка самораспространяющегося высокотемпературного синтеза (СВС) Научно-учебного центра СВС МИСиС-ИСМАН [10].

Для нанесения металлического покрытия применяли мишень из чистого титана (Ti). Осаждение покрытий Ti—Ca—P—C—O—N (мишень ТiC_0,5+Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) и Ti на подложку из ПТФЭ осуществляли в течение 60 мин путем магнетронного распыления композиционных мишеней в газовой смеси аргона с азотом при парциальном давлении азота 14%. В процессе напыления давление в вакуумной камере и температура подложки составляли соответственно 0,2 Пa и 120—150 °С. Толщина покрытия — 500 нм.

Для прививки на поверхности имплантатов биологического материала использовали клетки, выделенные из кожно-мышечной ткани зародышей человека на сроке 6—8 нед. Клетки культивировали в среде ДМЕМ/199 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone) и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина в атмосфере 5% СO₂. Для проведения исследований была использована культура клеток на 11-м пассаже (CD133-, Cd117-, CD45-, CD90+, CD54-, CD62L-, CD62P-, CD9+,CD34-, CD31-, CD71-, CD20-, CD157-, CD106+, CD62E+).

Клетки высевали на поверхность исследуемых образцов с плотностью 35 тыс./см² и культивировали в течение 72 ч. Морфологию и жизнеспособность клеток оценивали с помощью микроскопа Axiovert 2 («Карл Цейс», Германия) с использованием метода окрашивания 0,0002% раствором акридинового оранжевого в фосфатном буфере.

Для исследования методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) была проведена процедура фиксации клеток на поверхности материалов. По истечении 72 ч с момента посева клеток образцы промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ), рН 7,4, после чего фиксировали в течение 2 ч 2,5% раствором глутарового альдегида в ФСБ. После удаления фиксирующего раствора образцы промывали ФСБ и проводили дегидратацию материала; после удаления этанола образцы помещали на 30 мин в гексаметилдисилазан, после чего высушивали на воздухе. Окончательное высушивание образцов осуществляли методом перехода через критическую точку на аппарате Hitachi CPD-1 («Critical Point Dryer»), после чего их фиксировали на предметные столики и напыляли смесью золото-палладий, используя установку Eiko-IB3 («Ion coater») при следующем режиме: ионный ток — 6 мА, межэлектродное напряжение — 1,5 кВ, что позволяло получать толщину слоя напыления около 25 нм. Изучение объектов проводили на аппарате CamScan S-2 («Cambridge Scanning») в режиме регистрации вторичных электронов при ускоряющем напряжении 20 кВ. Захват и обработку видеоизображения на персональном компьютере реализовывали с использованием программно-аппаратного комплекса Microcapture 2.2 (система для микроскопии и анализа).

При культивировании клеток в присутствии всех исследуемых материалов не наблюдалось угнетения клеточной активности и гибели клеток, что показывает отсутствие водорастворимых фракций, оказывающих токсическое воздействие на клетки. Для визуализации клеток на поверхности исследуемых материалов был использован метод окрашивания акридиновым оранжевым. Данный краситель селективно взаимодействует с ДНК и РНК, при этом интеркалированная красителем двухцепочечная ДНК флюоресцирует в зеленом свете (525 нм), а электростатически связанный с РНК и одноцепочечной ДНК акридиновый оранжевый — в красной области (>630 нм), что делает возможной общую оценку состояния клеток [13]. Исследование показало, что нанесение нанопокрытий Ti и Ti—Ca—P—C—O—N приводит к повышению адгезионных характеристик материала по сравнению с таковыми у ПТФЭ без покрытия.

Образцы с модифицированной магнетронным напылением поверхностью характеризуются высокой жизнеспособностью клеток. Об этом свидетельствует нижеследующее:

— ядра клеток светятся зеленым светом, что характерно для интактного ДНК;

— в исследованных образцах нет окрашенных красным цветом ядер, что свидетельствует об отсутствии погибших клеток (рис. 1—3).

Для более детального изучения поведения клеток на поверхности образцов был использован метод СЭМ.

На электронограммах образцов ПТФЭ без покрытия преобладают относительно гладкие участки. Наблюдаются слабое распластывание клеток и тенденция к формированию небольших клеточных кластеров, что говорит о низкой адгезивности ПТФЭ (рис. 4).

На образцах материалов с нанопокрытиями Ti и Ti—Ca—P—C—O—N видны хорошо развитая поверхность материала и «заглубления» с отчетливой гранулярной структурой (рис. 5, 6).

Таким образом, модификация поверхности ПТФЭ путем магнетронного напыления наноструктурных покрытий Ti и Ti—Ca—P—C—O—N приводит к формированию развитой поверхности с оптимизированными физико-химическими свойствами, обусловливающими повышение адгезионного потенциала материала.

Приведенные результаты могут служить основанием для разработки в дальнейшем биоинженерных конструкций на основе мембран из ПТФЭ с наноструктурным покрытием.

Кроме того, представленную конструкцию на основе ПТФЭ целесообразно использовать в качестве экспериментальной модели для исследования биологически детерминированных взаимодействий в области контакта имплантат — периимплантационные тканевые элементы при различных характеристиках (химических, микроструктурных и т.д.) поверхности имплантатов. Такая возможность обусловлена технической доступностью ПТФЭ с разными видами покрытия для изучения современными методами (в том числе молекулярными, например иммуногистохимическими).

Исследование продемонстрировало повышение адгезионного потенциала ПТФЭ при модификации свойств его поверхности путем напыления нанопокрытий Ti и Ti—Ca—P—C—O—N. Результаты исследования открывают перспективы для создания биоинженерных конструкций на нерезорбируемом полимерном матриксе ПТФЭ и применения данных материалов с целью замены ими металлических имплантатов при пластике костных дефектов, в частности плоских костей, с использованием клеточных технологий.

Описанные конструкции предлагается также использовать как экспериментальные модели в научных исследованиях, направленных на раскрытие биологических механизмов взаимодействий в области контакта имплантат—периимплантационные тканевые элементы.