Введение
Эндометриоз — хроническое эстрогензависимое, иммунозависимое и генетически детерминированное заболевание, характеризующееся разрастанием ткани эндометрия вне полости матки. Этиология и патогенез эндометриоза остаются недостаточно изученными, что приводит к сложностям диагностики и недостаточно эффективному лечению этой патологии. Согласно теории ретроградного заброса отслоившийся при сокращениях матки эндометрий попадает в маточные трубы и брюшную полость во время сокращений матки. Однако показано, что ретроградная менструация наблюдается в 76—90% наблюдений, в то время как только у 6—10% женщин развивается эндометриоз [1]. В настоящее время считается, что пациентки с эндометриозом имеют генетические, биохимические или иммунологические нарушения, препятствующие удалению клеток эндометрия из брюшной полости и способствующие адгезии эндометрия к перитонеальным структурам [2, 3]. Было показано, что у женщин с эндометриозом нарушены функции множества типов иммунных клеток, включая нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, естественные клетки-киллеры, Т-хелперы и В-клетки [4—6], цитокинов и хемокинов, участвующих в воспалительном ответе, ангиогенезе и росте тканей [4,5, 7—10].
Гликоделин (Гд) A представляет собой разновидность гликопротеина, изначально экспрессируемого в секреторном эндометрии, децидуальной оболочке плода и амниотической жидкости, который жизненно важен для поддержания нормальной репродуктивной деятельности человека. ГдА способствует ангиогенезу, модулирует дифференцировку и функцию иммунных клеток, включая Т-клетки, дендритные клетки, моноциты, макрофаги, естественные клетки-киллеры и В-клетки, участвующие в канцерогенезе. Экспрессия ГдА может регулироваться стромальными клетками, лизофосфатидной кислотой, ингибиторами гистондеацетилазы и релаксином [11].
Установлено, что ГдА подавляет миграцию и инвазию клеток эндометрия, но усиливает прикрепление сфероидов (заменителей бластоцисты) [12].
Увеличение концентрации противовоспалительных цитокинов и факторов роста как в перитонеальной жидкости, так и в тазовой брюшине способствует развитию эндометриоидных очагов.
Одним из противовоспалительных цитокинов является трансформирующий фактор роста бета (ТФР бета), регулирующий различные функции клеток, включая адгезию, инвазию, ангиогенез, способствующий развитию эндометриоидных повреждений. В то же время значение его в патофизиологии эндометриоидных очагов недостаточно изучено.
V. Young и соавт. [13] установили, что уровень ТФР бета-1 повышен в перитонеальной жидкости (ПЖ), сыворотке, эктопированном эндометрии и брюшине у женщин с эндометриозом по сравнению с таковым у женщин без эндометриоза, а у мышей без ТФР бета-1 наблюдается замедление роста очагов эндометриоза по сравнению с этим процессом у их диких типов [13].
T. Hanada и соавт. [14] установили, что уровень ТФР бета в ПЖ при эндометриозе в пролиферативную фазу менструального цикла был выше, чем в контрольной группе. Авторы полагают, что одной из причин развития эндометрия в полости малого таза является активация ТФР бета, что требует проведения дальнейших исследований [14]. В настоящее время неизвестно, предшествует ли повышенный уровень ТФР бета-1 в ПЖ развитию эндометриоза или следует за ним. Однако, поскольку ретроградная менструация и наличие клеток эндометрия в брюшной полости могут вызывать воспаление, развитие эндометриоза и увеличение уровня ТФР бета-1, вероятно, будут протекать одновременно.
Воспаление брюшины с участием цитокинов, таких как ФНО альфа, и избыточная экспрессия ароматазы могут играть роль в процессе инвазии эндометриоза. ФНО альфа является секреторным фактором макрофагов, уровень которого увеличивается в ПЖ женщин с эндометриозом. ФНО альфа также влияет на рост эктопических повреждений. Исследование, проведенное M. Demir и соавт. [15], позволило установить, что показатель ФНО альфа в смывах полости матки при эндометриозе был существенно выше, чем у практически здоровых женщин.
Было установлено, что ФНО альфа может стимулировать адгезию и пролиферацию клеток эндометрия и усиливать экспрессию металлопротеиназ, облегчая таким образом инвазию клеток эндометрия. Он тоже стимулирует ангиогенез, регулируя экспрессию ИЛ-8. ФНО альфа также цитотоксичен по отношению к гаметам [16]. На моделях мышей и павианов с индуцированным эндометриозом было показано, что анти-ФНО альфа (ФНО-связывающий белок-1) уменьшает размеры эндометриоидных очагов [15, 17]. В то же время в эпителиальных клетках эндометриоидной ткани, а также в ткани эутопического эндометрия выявлена выраженная цитоплазматическая иммунореактивность ФНО альфа. Эти данные свидетельствуют, что ФНО альфа может быть вовлечен как в нормальные биологические процессы эндометрия, так и в патогенез эндометриоза [18].
Следует отметить, что имеются ограниченные и противоречивые сведения относительно показателей цитокинов и ГдА при рецидивирующем наружном генитальном эндометриозе (НГЭ). Кроме того, сложная связь между воспалением и наблюдаемым гормональным дисбалансом, а также стратегии иммуномодуляции недостаточно изучены, поэтому необходимы дополнительные хорошо спланированные исследования.
Цель нашей работы — изучение показателей ФНО альфа, ТРФ бета-1 и ГдА в ПЖ, эндометриоидных инфильтратах и биоптатах тазовой брюшины при рецидивирующем НГЭ.
Материал и методы
Были сформированы три группы пациенток, давших информированное согласие на проведение всех манипуляций, сбор материала и его исследование.
В основную группу были включены 48 больных с рецидивирующим НГЭ. Средний возраст обследуемых составил 34,96±1,1 года и колебался в пределах от 19 до 50 лет. Изучение особенностей менструальной функции позволило установить, что менархе отмечалась с 13,8±1,9 года, продолжительность менструального цикла была в пределах 28,75±0,53 дня (23—45 дней), длительность менструации составила 5,65±0,17 дня (3—10 дней). Начало половой жизни у больных отмечалось с 18,98±0,39 года (15—30 лет). Исследование репродуктивной функции позволило выявить, что у 15 (31,3%) из 48 пациенток отмечалось бесплодие, среди них первичное бесплодие было у 9 (18,8%). Среднее число беременностей у остальных обследованных больных составило 3,66±0,15 (1—3). При этом число родов составило в среднем 1,32±0,1 (1—2), медицинских абортов — 1,14±0,14 (0—2), самопроизвольных абортов — 1,2±0,2 (0—2). Длительность заболевания эндометриозом у больных с рецидивирующими формами НГЭ составила 6,1±0,84 года (1—15 лет). Частота рецидива в среднем колебалась в пределах 2,02±0,44 наблюдения (1—3). Длительность ремиссии была в среднем 10,0±1,41 года (9—11 лет).
В группу сравнения были включены 40 больных с впервые выявленным НГЭ. Средний возраст в данной группе составил 33,56±1,16 года (18—48 лет). Менархе у пациенток группы сравнения наступило в среднем в возрасте 12,6±0,86 года, продолжительность менструального цикла составила 28,21±0,38 дня (23—36 дней), длительность менструации составила 5,26±0,16 дня (3—7 дней). Возраст начала половой жизни составил 18,95±0,29 года (16—26 лет). В данной группе частота бесплодия составила 22,5% (у 9 из 40 больных), у 12,5% (у 5) из которых отмечалось первичное бесплодие. Среднее число беременностей у остальных женщин составило 2,4±0,02 (1—4), родов — 1,4±0,08 (1—3), абортов — 1±0,02 (0—2).
В контрольную группу вошли 10 женщин в репродуктивном периоде без клинико-лабораторных проявлений эндометриоза. Средний возраст женщин составил 34,5±2,5 года (27—40 лет). Менархе установилось с 13,1±0,8 года. Менструальный цикл установился сразу и составил 30,0±0,13 дня (25—36 дней), длительность менструации была в пределах 5,5±0,21 дня (3—5 дней). Половая жизнь была с 20,5±0,12 (19—22) года. Среднее число беременностей составило 2,5±0,11 (1—3), среди них родов 1,4±0,13 (1—2), абортов 1,1±0,8 (0—2).
Обследуемым больным в пролиферативную фазу менструального цикла проведено хирургическое вмешательство с использованием лапароскопического доступа под эндотрахеальным наркозом: иссечение/деструкция эндометриоидных инфильтратов/гетеротопий, резекция яичника и биопсия тазовой брюшины. Биопсию интактного участка тазовой брюшины проводили острым путем без предварительной коагуляции до начала основного этапа операции. Эндометриоидные инфильтраты иссекали также острым путем в пределах здоровых тканей с подлежащей инфильтрированной забрюшинной клетчаткой.
Удаленные во время операции ткани (эндометриоидный инфильтрат, биоптат тазовой брюшины) помещали в пробирки типа Эппендорф, замораживали и хранили в низкотемпературной морозильной камере при температуре –70 °C до момента выделения РНК не более 2 мес.
Кроме того, осуществляли забор перитонеальной жидкости (ПЖ) в объеме 3—5 мл из позадиматочного пространства до начала хирургического вмешательства. В последующем ПЖ с целью осаждения клеточных элементов центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Полученную надосадочную жидкость собирали в пробирку типа Эппендорф, замораживали при температуре –70 °C и хранили до момента исследования не более 2 мес.
У всех больных в ПЖ были исследованы уровни ГдА и ТФР бета1 методом иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА ТФР бета1 проводили с использованием набора Sea124Hu TGF-β1 Cloud-Clone Corp., США (DB100B), а ИФА ГдА выполняли с использованием набора АМГФ-Фертитест-М («Диатех-ЭМ», Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Планшеты ИФА считывали с помощью считывателя микропланшетов Lab Systems Multiscan EX при 450 нм с коррекцией длины волны при 540 нм. Образцы количественно определяли с использованием анализа стандартной кривой в пределах линейного диапазона от 4000 до 2 пг/мл для ТФР бета-1 и от 1000 до 2 нг/мл для ГдА, результаты считывания сохраняли в приборе.
В тканях эндометриоидных инфильтратов и биоптатах тазовой брюшины определяли экспрессию генов ТФР бета-1 и ФНО альфа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Замороженные образцы деградировали, гомогенизировали и выделяли общую РНК, используя коммерческий набор «Прота-НК» согласно инструкции фирмы-производителя. Обратно-транскриптазную реакцию проводили с использованием коммерческого набора «Реверта-L», согласно инструкции фирмы-производителя.
ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием прибора «Амплификатор детектирующий ДТлайт». Для приготовления реакционной смеси общим объемом 20 мкл на одну пробирку вносили 2 мкл кДНК, по 2 мкл прямого и обратного праймера, 4 мкл смеси qPCRmix-HS SYBR, 10 мкл стерильной воды. Амплификацию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация — 1 цикл при температуре 95 °C 5 мин, денатурация — 1 цикл при температуре 95 °C 15 с; отжиг праймера при температуре 56 °C — 20 с; элонгация при при температуре 72 °C — 30 с. Всего 45 циклов. Дополнительным этапом после амплификации была добавлена кривая плавления при температуре от 55 до 95 °C по 5 с, сопровождающаяся детекцией флуоресцентного сигнала. ПЦР проводили в режиме реального времени в детектирующем амплификаторе ДТ-96 с использованием готовой смеси для ПЦР qPCRmix-HSSYBR и со специфичными праймерами для выбранных генов-кандидатов:
ФНОα-forTCTTCTCGAACCCCGAGTGA
ФНОα-revCCTCTGATGGCACCACCAG
ТФРβ-forCAGCAACAATTCCTGGCGATA
ТФРβ-revAAGGCGAAAGCCCTCAATTT
Уровень экспрессии матричной РНК (мРНК) для каждого гена определяли в относительных единицах согласно методике, предложенной J. Vandesompele и соавт. В 2002 г. [19]. При этом меньшему показателю цикла амплификации (АЦ) соответствовал больший уровень экспрессии гена.
Данные проанализированы с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc.). Характер распределения анализируемых параметров в выборках оценивали с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. В случае нормально распределенных показателей использовали тест t, для распределений, отличных от нормального, использовали непараметрический критерий U Манна—Уитни. Результаты представляли в виде медианы и квартилей, минимальных и максимальных значений. Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
В результате проведенного исследования на основании использования эндоскопических и морфологических методов было выявлено, что при рецидивирующем НГЭ в основной группе распространенность эндометриоидных инфильтратов составила 97,9%, а при впервые выявленном НГЭ (группа сравнения) — 97,5%. Кроме того, с высокой частотой выявлялись эндометриоидные кисты яичников: при рецидивирующем НГЭ — у 93,7% больных (из них 70,7% были односторонними), при впервые выявленном НГЭ — у 92,5% (среди них 57,5% были односторонними).
Результаты определения ТФР бета-1 и ГдА в ПЖ при рецидивирующем и впервые выявленном НГЭ представлены в табл. 1.
Таблица 1. Показатели уровней ТФР бета-1 и ГдА в перитонеальной жидкости при рецидивирующем и впервые выявленном НГЭ
| Показатель | НГЭ | Контрольная группа | p | |
| Основная группа (рецидивирующий) | Группа сравнения (впервые выявленный) | |||
| ТФР бета-1, пг/мл | 1460,4 [1144,95; 1891,8], (431,41 — 5616,22) 1 | 1562 [1435,43; 1998,8], (630,6—5928,12) 2 | 1095,15 [962,4; 1227,9], (352,4—1524,22) 3 | p1—2=0,651 p1—3<0,037 p2—3<0,011 |
| ГдА, нг/мл | 30,4 [20,28; 88,75], (6,95—499,34) 4 | 32,7 [15,55;86,0], (3,1—760,25) 5 | 37,75 [14,9;60,6], (8,23—65,44) 6 | p4—5>0,65 p4—6<0,614 p5—6<0,327 |
При проведении ИФА выявили, что уровни ТФР бета-1 в ПЖ при рецидивирующем и впервые выявленном НГЭ статистически значимо не различались. В то же время в сравнении с уровнем контрольной группы ТФР бета-1 был достоверно выше в обеих обследуемых группах (p<0,05; табл. 1).
Результаты ИФА ГдА в ПЖ не демонстрировали статистически значимых различий между обследуемыми и контрольной группами в связи с широким разбросом индивидуальных показателей. Однако в 20% наблюдений группы сравнения и в 30,1% наблюдений основной группы отмечались чрезвычайно высокие уровни ГдА, превышающие в десятки раз максимальные показатели контрольной группы (см. табл. 1).
Результаты определения экспрессии генов ТФР бета-1 и ФНО альфа в тканях эндометриоидного инфильтрата и тазовой брюшины при рецидивирующем и впервые выявленном НГЭ представлены в табл. 2.
Таблица 2. Показатели экспрессии генов ТФР бета1 и ФНО-α в тканях эндометриоидного инфильтрата и тазовой брюшины при рецидивирующем и впервые выявленном НГЭ
| Группа | Исследуемая ткань | ТФР бета-1, (цикл амплификации, АЦ) | ФНО альфа, АЦ |
| Основная, n=48 | Эндометриоидный инфильтрат | 26,45 [25,60;28,60] 1 | 29,30 [28,10; 31,25] 6 |
| Интактная тазовая брюшина | 28,55 [26,95; 29,70] 2 | 31,4 [29,98; 32,35] 7 | |
| Группа сравнения, n=40 | Эндометриоидный инфильтрат | 28,1 [24,6; 30,75] 3 | 27,1 [25,13; 30,25] 8 |
| Интактная тазовая брюшина | 30,85 [30,2; 32,5] 4 | 31,1 [29,15; 32,7] 9 | |
| Контрольная группа, n=10 | Тазовая брюшина | 35,4 [33,5; 36,5] 5 | 32,7 [31,05; 34,05] 10 |
| p | — | p1—3=0,344 p2—4<0,001 p2—5=0,002 p4—5>0,184 | p6—8=0,031 p7—9=0,851 p7—10=0,003 p9—10=0,016 |
Примечание. Меньшему показателю АЦ соответствует больший уровень экспрессии гена.
При проведении ПЦР в интактной тазовой брюшине выявили повышенную экспрессию гена ТФР бета-1 при эндометриозе (p<0,05) в сравнении с таковой в контрольной группе, максимальную — при рецидивирующем варианте НГЭ.
Уровень экспрессии гена ТФР бета-1 в эндометриоидном инфильтрате при рецидивирующем НГЭ не отличался от показателя больных с впервые выявленным НГЭ (p>0,05). При этом наиболее высокий уровень экспрессии гена ТФР бета-1 отмечался у пациенток основной группы.
Изучение уровня экспрессии гена ФНО альфа в эндометриоидном инфильтрате позволило установить более высокий ее уровень при впервые выявленном НГЭ по сравнению с рецидивирующим (p<0,05). В интактной тазовой брюшине показатели экспрессии гена ФНО альфа как при рецидивирующем (основная группа), так и при впервые выявленном НГЭ (группа сравнения) были выше, чем в контрольной группе, в то же время статистически значимо не различаясь между собой (см. табл. 2).
По данным некоторых авторов, мезотелиальные клетки, выстилающие брюшную полость, могут способствовать развитию и поддержанию перитонеального эндометриоза [20, 21]. Они обеспечивают поверхность для прикрепления эктопических клеток эндометрия, облегчают их инвазию посредством ремоделирования ткани [22], а также секретируют широкий спектр провоспалительных цитокинов и факторов роста, которые могут способствовать усилению клеточной пролиферации и ангиогенеза [23]. Реакция брюшины на различные виды повреждений включает потерю перитонеальных мезотелиальных клеток, передачу сигналов опасности, эпителиально-мезенхимальный переход и мезотелиально-мезенхимальный переход. Брюшина и, в частности, мезотелий брюшины, является источником ТФР бета-1, и его концентрация усиливается вокруг очагов эндометриоза. Экспрессия генов, регулируемых ТФР бета-1, изменена в брюшине женщин с эндометриозом, и это может способствовать созданию среды, благоприятной для образования поражений [20]. У мышей с нулевым ТФР бета 1 было значительно уменьшено количество макрофагов в поражениях, подобных эндометриозу, по сравнению с таковым у мышей дикого типа, что позволяет предположить, что ТФР бета-1 играет решающую роль в привлечении макрофагов к поражениям [24].
Постоянно высокие уровни ТФР бета-1 и/или стимуляция воспалительными цитокинами индуцируют перитонеальный мезотелиально-мезенхимальный переход, образование спаек и фиброз. ТФР бета-1 связан с изменениями метаболизма эктопических эндометриальных и перитонеальных клеток и инициацией неоангиогенеза, что дополнительно подпитывает развитие очагов эндометриоза [13]. Эпителиально-мезенхимальный переход перитонеальных мезотелиальных клеток также способен привести к усилению инвазии и образованию фиброзной ткани внутри и вокруг поражения. У женщин с эндометриозом может быть снижена перитонеальная иммунная очистительная функция: наблюдается заметное увеличение продуктов секреции макрофагов, связанное с увеличением клеточной пролиферации, клеточной адгезии и неоваскуляризации [21]. Эти исследования показывают, что ТФР бета-1 играет важную роль в развитии поражений перитонеальным эндометриозом и что воздействие на этот путь может иметь терапевтический потенциал. ТФР бета-1 усиливает экспрессию индуцируемого гипоксией фактора 1α, который управляет ростом клеток, производством внеклеточного матрикса и миграцией клеток. Нарушение перитонеального гликокаликса и обнажение базальной мембраны высвобождают низкомолекулярный гиалуронан, который инициирует каскад провоспалительных медиаторов, включая перитонеальные цитокины: ФНО альфа, интерлейкин (ИЛ)-1, ИЛ-6, простагландины, факторы роста — ТФР альфа, ТФР бета, тромбоцитарный фактор роста, фактор роста эндотелия сосудов, эпидермальный фактор роста и каскад фибрина/коагуляции — тромбин, тканевой фактор, ингибитор активатора плазминогена [PAI]-1/2) [25].
Заключение
В некоторых исследованиях установлено, что значительно более высокие концентрации ГдА выявлены в сыворотке крови и в перитонеальной жидкости больных с эндометриозом по сравнению с таковыми в контрольной группе, что в определенной степени совпадает с результатом наших исследований. Интенсивность и частота альгоменореи при эндометриозе положительно коррелировали с концентрацией ГдА [26, 27].
Таким образом, высокие уровни ГдА при НГЭ (20% наблюдений из группы сравнения и 30,1% наблюдений из основной группы), превышающие в десятки раз максимальные показатели контрольной группы, свидетельствуют, что ГдА может послужить биомаркером для диагностики и прогнозирования эндометриоза, а учитывая его иммунорегуляторные свойства, можно предполагать, что гликоделин является возможной мишенью для иммунотерапии.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Фарах Т. Алиева, Д.В. Брюнин, А.А. Бахвалова
Сбор и обработка материала — Фарах Т. Алиева, Фидан Т. Алиева, А.П. Алексанкин, Н.Б. Тихонова, А.А. Бахвалова
Статистическая обработка — К.А. Артемьева, В.В. Алексанкина
Написание текста — Фарах Т. Алиева, К.А. Артемьева
Редактирование — Д.В. Брюнин, М.Н. Болтовская, А.А. Бахвалова
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept and design of the study — Farakh T. Alieva, D.V. Bryunin, A.A. Bakhvalova
Data collection and processing — Farakh T. Alieva, Fidan T. Alieva, A.P. Aleksankin, N.B. Tikhonova, A.A. Bakhvalova
Statistical processing of the data — K.A. Artem’eva, V.V. Aleksankina
Text writing — Farakh T. Alieva, K.A. Artem’eva
Editing — D.V. Bryunin, M.N. Boltovskaya, A.A. Bakhvalova
Authors declare lack of the conflicts of interests.