Введение
Патологические процессы в эндометрии представляют собой серьезную медико-социальную проблему. Так, гиперплазия и полипы эндометрия встречаются более чем у 50% женщин в позднем репродуктивном периоде и во время перименопаузы [1—4] и являются одной из наиболее распространенных причин маточного кровотечения [5, 6]. Озлокачествление железистой гиперплазии и полипа эндометрия отмечается у 2—5% женщин и в постменопаузе достигает 10% [2, 3].
Рост клеток эндометрия происходит под влиянием гормонов яичников и локально продуцируемых факторов, включающих цитокины, нейропептиды и факторы роста. Большое значение в нормальном функционировании эндометрия играет также апоптоз, точные регуляторные механизмы которого остаются неясными.
Одним из наиболее важных факторов, опосредующих динамику роста и изменений клеток эндометрия и регулирующих клеточный апоптоз, является трансформирующий фактор роста бета-1 (ТФР-β1) [7].
И ТФР-β1, и его рецепторы постоянно экспрессируются в эндометрии, что свидетельствует о том, что эндометриальный ТФР-β1 оказывает локальное влияние, проявляющееся на протяжении всего менструального цикла. Следует отметить, что ТФР-β1 оказывает ингибирующее действие на рост как эпителиальных, так и стромальных клеток эндометрия человека. ТФР-β1 оказывает значительный аутокринный и/или паракринный проапоптотический эффект в отношении стромальных клеток эндометрия человека в культуре. Сигнальные пути ТФР-β/Smad и PI3K/AKT служат важными регуляторами пролиферации и апоптоза, и их изменения приводят к развитию рака. ТФР-β1 действует как супрессор опухоли в предраковых клетках, но является промотором опухоли для раковых клеток [8].
ФНО-α — цитокин, продуцируемый моноцитами, макрофагами, эндотелиальными и тучными клетками. ФНО-α индуцирует апоптоз, обусловливает синтез белков острой фазы воспаления, стимулирует ангиогенез. В некоторых исследованиях показано, что ФНО-α усиливает локальный синтез эстрогенов в клетках эндометрия [9, 10]. Известно, что ФНО-α циклически экспрессируется в нормальном эндометрии человека [11, 12]. Показано, что воспаление является критическим фактором онкогенеза и, как предполагается, способствует развитию рака эндометрии. Так, продемонстрирована положительная связь между уровнями ФНО-α в сыворотке и риском развития рака эндометрия, а также снижение этого риска путем ингибирования воспаления нестероидными противовоспалительными препаратами. F. Garcia и соавт. [13] продемонстрировали, что доброкачественные поражения эндометрия (эндометриальные полипы) содержат небольшое количество матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) или белка ФНО-α, в то время как поражения с большей пролиферативной активностью (гиперплазия и аденофиброма) демонстрируют повышенную экспрессию ФНО-α. Экспрессия адипокинов (включая ФНО-α и интерлейкин-6 — IL-6) локализована преимущественно в строме и связана с развитием рака эндометрия, высокой степенью риска его развития и его рецидивом [14], что может быть объяснено, по крайней мере, частично взаимовлиянием ФНО-α и эстрогена. Например, отмена эстрогена приводила к усилению экспрессии ФНО-α в эпителиальных клетках эндометрия и, наоборот, снижение экспрессии ФНО-α усиливало локальный синтез эстрогена в клетках эндометрия [11, 12, 15]. ФНО-α может также оказывать прямое пролиферативное действие на эндометрий или способствовать его ангиогенезу [15, 16].
Гликопротеин гликоделин A (ГдА) представляет собой иммуномодулирующий фактор, секретируемый эндометрием под контролем прогестерона. ГдА оказывает ингибирующее действие на пролиферацию T- и B-лимфоцитов, а также на активность естественных клеток-киллеров. Ингибирующее действие ГдА на пролиферацию T-клеток обусловлено апоптозом, индуцированным в этих клетках через каспазозависимый внутренний митохондриальный путь. Кроме того, ГдА модулирует адаптивные иммунные реакции [17]. ГдА способен регулировать пролиферацию, дифференцировку и инвазию раковых клеток, способствовать ангиогенезу рака, и модулировать дифференцировку и функцию иммунных клеток, включая T-клетки, дендритные клетки, моноциты-макрофаги, естественные клетки-киллеры и B-клетки, участвующие в развитии рака. Таким образом, ГдА может быть многообещающим биомаркером для диагностики и прогнозирования онкологических заболеваний, а в связи с его иммунорегуляторными эффектами и перспективной мишенью для иммунотерапии рака [18].
Следует отметить, что имеющиеся сведения об особенностях изменения синтеза и экспрессии ТФР-β1, ФНО-α и ГдА при патологических изменениях эндометрия в пре- и постменопаузе ограничены и противоречивы [19, 20]. Исходя из актуальности проблемы определена цель настоящего исследования: изучить диагностическую значимость уровней ТФР-β1, ФНО-α и ГдА при патологии эндометрия в пре- и постменопаузе.
Материал и методы
В 1-ю группу исследования были включены 73 пациентки с различной патологией эндометрия в пременопаузе, средний возраст которых составил 47,82±0,27 (45—51) лет. Во 2-ю группу вошли 47 пациенток с различными клиническими проявлениями патологии эндометрия в постменопаузе. Средний возраст обследованных женщин в постменопаузе составил 58,43±1,1 года и колебался в пределах от 47 до 74 лет. Длительность постменопаузы составила 8,49±1,12 (1,5—3,2) года. Изучение анамнестических данных позволило выявить особенности менструальной и репродуктивной функции у пациенток обеих групп (табл. 1).
Таблица 1. Особенности менструальной и репродуктивной функции у пациенток обследованных групп
| Группа | Средний возраст, годы | Менархе, годы | Продолжительность МЦ, дни | Длительность менструации, дни | Начало половой жизни, годы | Общее число беременностей | Число родов | Число медицинских абортов | Число самопроизвольных абортов |
| 1-я группа, n=73 | 47,82±0,27 (45—51) | 11,0±0,15 (11—17) | 27,24±0,47 (21—45) | 5,1±0,14 (3—8) | 19,5±0,57 (16—31) | 5,2±0,02 (1—10) | 1,72±0,11 (1—4) | 1,57±0,11 (0—4) | 1,91±0,34 (0—4) |
| 2-я группа, n=47 | 58,43±1,1 (47—74) | 12,97±0,2 (11—17) | 28,13±0,16 (26—30) | 5,3±0,18 (3—9) | 20,68±0,51 (18—26) | 5,4±0,36 (1—7) | 1,58±0,1 (1—3) | 1,38±0,18 (0—2) | 1,32±0,17 (0—2) |
Примечание. МЦ — менструальный цикл.
Контрольные группы составили женщины, находящиеся в пременопаузе (n=10) и в постменопаузе (n=10), у которых отсутствовала патология эндометрия.
Средний возраст женщин контрольной группы в пременопаузе составил 46,15±0,36 года (43—48 лет). Изучение менструальной и репродуктивной функции позволило установить, что менархе отмечалась с 12,0±0,18 года (11—15 лет), длительность менструального цикла была в пределах 26,36±0,21 дня (25—42 дня), длительность менструаций — 5,5±0,17 дня (3—7) дней. Половая жизнь начиналась с 18,3±0,45 года (16—28 лет). Число беременностей составило 3,2±0,11 (1—7), родов — 1,8±0,12 (1—3), абортов — 1,4±0,11 (0—4).
В контрольной группе женщин, находящихся в постменопаузе, средний возраст составил 62,0±3,27 года (49—74 года). Менархе у этих пациенток наступила в среднем с 12,8±0,26 года, продолжительность менструального цикла составила 28,25±0,45 дня (26—30 дней), длительность менструации составила 5,5±0,42 дня (4—7 дней). Возраст начала половой жизни составил 19,6±0,68 года (18—22 года). Среднее число беременностей составило 7±2,12 (1—13), среди них родов — 1,6±0,26 (1—3), абортов — 5,4±2,7 (0—10). Длительность постменопаузального периода составила 13,1±3,75 года (2—32 года).
У всех обследуемых пациенток перед оперативным вмешательством брали образцы венозной крови в количестве 6 мл для иммуноферментного анализа (ИФА). Кровь была собрана в пробирку, подвергалась центрифугированию при 1500 об/мин в течение 15 мин. Полученную надосадочную жидкость собирали в пробирки типа эппендорф, замораживали при —70 °C и хранили до момента исследования не более 2 мес.
В сыворотке крови были исследованы ГдА и ТФР-β1 методом ИФА. Оценку содержания ТФР-β1 проводили с использованием набора Sea124Hu ТФР-β1 Cloud-Clone Corp., а ГдА — с использованием набора АМГФ-Фертитест М в соответствии с инструкциями производителя. Планшеты для ИФА считывали с помощью считывателя микропланшетов Lab Systems Multiscan EX при 450 нм с коррекцией длины волны при 540 нм. Исследуемые факторы количественно определяли с использованием анализа стандартной кривой в пределах линейного диапазона от 4000 до 2 пг/мл для ТФР-β1 и от 1000 до 2 нг/мл для ГдА, результаты считывания сохраняли в приборе. Полученные результаты сравнивали с аналогичными показателями женщин, находящихся в пре- и постменопаузе, без патологии эндометрия.
Биопсийный материал у пациенток забирали во время гистероскопического/гистерорезектоскопического исследования. Все лица, участвующие в исследовании, в соответствии с законами РФ подписали необходимые документы о добровольном информированном согласии на медицинское вмешательство и публикацию полученных данных (без идентификации личности). Интраоперационно отбирали биоптаты с последующим замораживанием и хранением в низкотемпературной морозильной камере при температуре –70 °C до момента выделения РНК.
Биоптаты размораживали, гомогенизировали и выделяли общую РНК, используя коммерческий набор «Прота-НК» согласно инструкции фирмы-производителя. Обратно-транскриптазную реакцию проводили с использованием коммерческого набора «Реверта-L», согласно инструкции фирмы-производителя.
Полимеразную цепную реакция (ПЦР) проводили в режиме реального времени в детектирующем амплификаторе ДТ-96 с использованием готовой смеси для ПЦР qPCRmix-HSSYBR и со специфичными праймерами для выбранных генов-кандидатов:
ФНОα-forTCTTCTCGAACCCCGAGTGA
ФНОα-revCCTCTGATGGCACCACCAG
ТФРβ-forCAGCAACAATTCCTGGCGATA
ТФРβ-revAAGGCGAAAGCCCTCAATTT
Уровень экспрессии матричной РНК (мРНК) для каждого гена определяли в относительных единицах согласно методике, предложенной J. Vandesompele и соавт. в 2002 г. [21]. При этом меньшему показателю цикла амплификации соответствовал больший уровень экспрессии гена.
Данные были проанализированы с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc., США). Характер распределения анализируемых параметров в выборках оценивали с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. В случае нормально распределенных показателей использовали критерий t-, для распределений, отличных от нормального — непараметрический критерий U Манна—Уитни. Результаты представляли в виде средних, медианы и квартилей, минимальных и максимальных значений. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
На основании клинических, функциональных, гистологических исследований определена частота различных видов патологии эндометрия у пациенток в пре- и постменопаузе (табл. 2).
Таблица 2. Частота различных видов патологии эндометрия у пациенток обследованных групп в пременопаузе, n=73 и постменопаузе, n=47
| Патология эндометрия | Абсолютное число | % |
| Пременопауза (1-я группа) | ||
| Полип эндометрия | 40 | 54,8 |
| Гиперплазия эндометрия | 15 | 20,5 |
| Хронический эндометрит | 9 | 12,4 |
| Сочетание диффузной гиперплазии эндометрия и субмукозной лейомиомы | 7 | 9,6 |
| Аденокарцинома эндометрия | 2 | 2,7 |
| Постменопауза (2-я группа) | ||
| Полип эндометрия | 29 | 61,7 |
| Хронический эндометрит | 11 | 23,4 |
| Диффузная гиперплазия эндометрия | 3 | 6,4 |
| Карцинома эндометрия | 3 | 6,4 |
| Атипическая гиперплазия эндометрия | 1 | 2,1 |
В пременопаузе патология эндометрия проявлялась преимущественно наличием полипа эндометрия (54,8%), гиперплазии эндометрия (20,5%), хронического эндометрита (12,4%), сочетания диффузной гиперплазии эндометрия и субмукозной лейомиомы матки (9,6%).
В постменопаузе наиболее частой патологией эндометрия являлись полип эндометрия (61,7%) и хронический эндометрит (23,4%).
Уровень ТФР-β1 в сыворотке крови пациенток в пременопаузе без патологии эндометрия (контрольная группа) был статистически значимо выше (табл. 3), чем у пациенток 1-й группы с патологией эндометрия и в контрольной группе без патологии эндометрия в постменопаузе. В постменопаузе достоверные различия по уровням ТФР-β1 между группами отсутствовали. Содержание ГдА в сыворотке крови пациенток 1-й основной группы было значительно выше, чем у пациенток контрольной группы в пременопаузе (см. табл. 3).
Таблица 3. Уровни ТФР-β1 и ГдА в сыворотке крови обследованных пациенток в пре- и постменопаузе, Me [Q1; Q3]
| Группа | ТФР-β 1, пг/мл | ГдА, нг/мл | |
| Пременопауза: | |||
| С патологией эндометрия (1-я группа) | 59,28 [39,17; 86,27] 1 | 0,67 [0,33; 3,93] 5 | |
| Без патологии эндометрия (контрольная группа) | 98,59 [78,41;132,38] 2 | 0,3 [0,17; 2,14] 6 | |
| Постменопауза: | |||
| С патологией эндометрия (2-я группа) | 73,84 [62,92; 103,24] 3 | 0,14 [0,06; 0,36] 7 | |
| Без патологии эндометрия (контрольная группа) | 64,48 [60,84; 84,03] 4 | 0,18 [0,18;0,25] 8 | |
| Значимость различий | p1—2=0,028 p1—3=0,139 p2—-4=0,046 p3—4= ,379 | p5—6=0,005 p5—7=0,032 p6—8=0,046 p7—8=0,32 | |
Изучение ГдА позволило выявить статистически значимо более высокие уровни данного гликопротеина у пациенток как 1-й основной, так и контрольной групп в пременопаузе по сравнению с таковыми 2-й основной и контрольной групп в постменопаузе.
Экспрессия генов ФНО-α в ткани эндометрия была более высокой в постменопаузе у пациенток с патологией эндометрия по сравнению с таковой в контрольной группе (табл. 4). Контрольная группа в пременопаузе характеризовалась более высокой экспрессией ФНО-α по сравнению с этим показателем контрольной группы в постменопаузе. Уровень экспрессии ТФР-β1 статистически значимо не различался во всех группах.
Таблица 4. Показатели экспрессии генов ФНО-α и ТФР-β1 (отн. ед.) в тканях эндометрия обследованных пациенток в пре- и постменопаузе, Me [Q1; Q3]
| Группа | ФНО-α, цикл амплификации | ТФР-β1, цикл амплификации | |
| Пременопауза: | |||
| С патологией эндометрия (1-я группа) | 21,7 [21,55; 25,05] 1 | 38,6 [38,55; 39,05] 5 | |
| Без патологии эндометрия (контрольная группа) | 21,9 [21,6; 22,2] 2 | 38,9 [38,8; 39] 6 | |
| Постменопауза: | |||
| С патологией эндометрия (2-я группа) | 22,55 [21,1; 26,08] 3 | 38,8 [38,53; 38,9] 7 | |
| Без патологии эндометрия (контрольная группа) | 24,35 [23,48; 26,3] 4 | 39,2 [38,5; 39,63] 8 | |
| Значимость различий | p1—2=0,379 p1—3=0,988 p2—4=0,007 p3—4<0,001 | p5—6=0,188 p5—7=0,596 p6—8=0,238 p7—8=0,242 | |
Примечание. Меньшему показателю цикла амплификации соответствует больший уровень экспрессии гена.
Заключение
Выявлено, что патологические изменения в эндометрии в пременопаузе сопровождались системным снижением содержания ТФР-β1 и повышением уровня ГдА. В то же время различным видам патологии эндометрия в постменопаузе сопутствовали локальные изменения, представленные увеличением экспрессии ФНО-α в эндометрии. Чаще всего патологические процессы в эндометрии у женщин в пре- и постменопаузе протекают малосимптомно, в то же время риск развития злокачественных новообразований у них достаточно высок [4]. Повышенный уровень маркеров воспаления, даже преходящий, может негативно влиять на состоянии эндометрия у пациенток старшей возрастной группы.
С учетом полученных данных можно предположить, что определение уровней ТФР-β1 и ГдА в сыворотке крови и экспрессии генов ТФР-β1 и ФНО-α в ткани эндометрия может быть полезным дополнением к традиционным методам диагностики патологии эндометрия у больных в пре- и постменопаузе, а также может позволить начать поиск новых путей эффективного терапевтического воздействия на эту патологию.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Фидан Т. Алиева, Д.В. Брюнин, А.А. Бахвалова
Сбор и обработка материала — Фидан Т. Алиева, Фарах Т. Алиева, А.П. Алексанкин, Н.Б. Тихонова, А.А. Бахвалова
Статистическая обработка — К.А. Артемьева, В.В. Алексанкина
Написание текста — Фидан Т. Алиева, К.А. Артемьева
Редактирование — Д.В. Брюнин, М.Н. Болтовская, А.А. Бахвалова
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept of the study — Fidan T. Alieva, D.V. Bryunin, A.A. Bakhvalova
Data collection and processing — Fidan T. Alieva, Farakh T. Alieva, A.P. Aleksankin, N.B. Tikhonova, A.A. Bakhvalova
Statistical processing of the data — K.A. Artem’eva, V.V. Aleksankina
Text writing — Fidan T. Alieva, K.A. Artem’eva
Editing — D.V. Bryunin, M.N. Boltovskaya, A.A. Bakhvalova
Authors declare lack of the conflicts of interests.