Несмотря на общий прогресс в области перинатальной медицины, пороки развития по-прежнему остаются основными причинами неонатальной заболеваемости и смертности [1]. Врожденная диафрагмальная грыжа (ВДГ), по данным разных авторов, встречается примерно у 1 на 3000 живорожденных [2, 3], и чаще — у мальчиков [4]. Причем за последние десятилетия частота данного порока существенно увеличилась [3]. Постнатальная терапия, такая как экстракорпоральная мембранная оксигенация, применение оксида азота, введение сурфактанта и высокочастотная вентиляция показали ограниченное влияние на прогноз и выживаемость при ВДГ [5].

Первоначально предполагалось, что гипоплазия легких при ВДГ является вторичной по отношению к механическому сжатию легкого абдоминальным содержимым. В последнее время превалирует гипотеза, согласно которой первоначальные изменения происходят на стадиях органогенеза, что приводит к двусторонней гипоплазии с последующим сжатием легких. В конечном итоге это определяет уменьшение разветвления бронхиол и легочных сосудов, что обеспечивает гипоплазию ацинусов. Гипоплазия легочной сосудистой сети объясняет легочную гипертензию (ЛГ) [6, 7]. В свою очередь это приводит к дисфункции желудочков сердца: недостаточному развитию левого желудочка и гипертрофии правого [8, 9].

Были предприняты многочисленные хирургические вмешательства на плоде при ВДГ. Открытые операции на диафрагме не увеличили выживаемость новорожденных с данным пороком [10].

За 20 лет наблюдений было показано, что минимально инвазивная фетоскопическая окклюзия трахеи (FETO) усиливает эмбриональный рост легких. Эндотрахеальный баллон, обтурируя трахею, предотвращает отток жидкости из легких, что вызывает увеличение растяжения легких и ускоряет их рост [11]. В настоящее время под руководством J. Deprest проводится многоцентровое рандомизированное исследование по влиянию FETO на выживаемость и исходы при левосторонней ВДГ с умеренной легочной гипоплазией, завершение которого планируется в конце 2018 г. По имеющимся в настоящее время данным [12], инвазивная процедура FETO увеличивает выживаемость при тяжелой левосторонней ВДГ с 24,1 до 49,1%, а при правосторонней — с 0 до 35%. По данным ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества», выживаемость при левосторонней ВДГ с летальной гипоплазией легких увеличилась до 50% [13, 14]. Однако при выполнении данной инвазивной процедуры возможны осложнения как при проведении операции, так и в послеоперационном периоде. Кроме того, требуются специальное оборудование и опытная обученная команда для проведения баллонной окклюзии трахеи плоду. Наиболее частым осложнением FETO являются преждевременные роды, каждые третьи роды проходят до 34 нед гестации [15]. Команда хирургов может столкнуться с трудностями окклюзии, приводящими к смерти плода или повреждению трахеи, что впоследствии приводит к трахеомегалии у новорожденного [16].

Таким образом, неудовлетворенность исходами внутриутробной хирургической коррекции определяет поиск альтернативных, нехирургических пренатальных методов лечения легочной гипоплазии при ВДГ.

Одним из первых препаратов, использованных в эксперименте по коррекции гипоплазии легких плода на фоне ВДГ, была ретиноевая кислота (РК).

Ретиноевая кислота является биологически активным метаболитом ретиноидов, производных витамина А. Ретиноиды необходимы для нормального развития различных органов во время эмбриогенеза, включая легкие и диафрагму. В развитии легких ретиноиды играют важную роль на каждой стадии развития. Агенезия легких, наблюдаемая у эмбрионов при состоянии острого дефицита ретинола у матери, доказывает важность ретиноидов при стимуляции начального почкования легких [17]. Основная роль РК в морфогенезе легкого заключается в выборочном поддержании мезодермальной пролиферации и индуцировании экспрессии 10-го фактора роста фибробластов [18]. Кроме того, РК влияет на васкуляризацию легких, стимуляцию пролиферацию пневмоцитов II типа [19]. D. Cipollone и соавт. [20] в своем недавнем исследовании продемонстрировали, что после введения тройного антагониста ретинола BMS-189453 (Е-4−2-5,6-дигидро-5,5-диметил-8-фенил-2-нафталинил-этенил бензойной кислоты) беременным мышам у плодов развиваются множественные пороки развития, в том числе ВДГ. На человеческих плодах влияние РК на развитие легких впервые показали в своем исследовании C. Loo и соавт. [21]. Они продемонстрировали значительную корреляцию между массой легкого и экспрессией ретинолсвязывающего белка cRBP-1 в гепатоцитах плода, где в норме хранится большая часть РК у человека. Все это, по-видимому, отражает аномальный обмен РК у плодов с ВДГ [21].

Пренатальное введение РК дало хорошие результаты в исследованиях на нитрофеновой модели ВДГ у крыс. S. Montedonico и соавт. [22] показали, что после введения РК беременным крысам у плодов увеличивались общий объем легких, площадь поверхности газообмена, общее количество альвеол. Однако в исследовании под руководством A. Schmidt [23] пренатальное введение РК не вызывало изменения морфометрии легких, но положительно влияло на сосудистую морфометрию — уменьшалась толщина медиальной стенки артериол, что свидетельствует о потенциальной способности уменьшать ЛГ. К тому же, введение РК восстанавливало нарушенную экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) [23].

Исследование на кроликах также не показало улучшения морфометрии легких в ответ на введение РК, в том числе не изменялась относительная масса легких. Однако нормализовалось нарушенное соотношение пневмоцитов I и II типа [24].

Исследование на хирургической модели ВДГ у ягнят после введения ретинилпальпитата (витамина А) показало более низкий уровень PCO₂ (парциального давления углекислого газа) и более высокий рН артериальной крови. Гистология выявила уменьшение толщины межальвеолярных перегородок и увеличение воздушных пространств. Однако относительная масса легких не увеличивалась и была даже несколько ниже, чем у ягнят с ВДГ без введения витамина, А [25].

Особый интерес представляют исследования по изучению влияния комбинированного применения FETO и РК в моделях ВДГ на крысах [26] и кроликах [27]. В обоих исследованиях было отмечено благоприятное влияние на легочную васкуляризацию — уменьшалась толщина медиальной стенки артериол, нормализовалась экспрессия VEGF и гена рецептора эндотелина-1 (ETA), а также восстанавливалась дифференцировка пневмоцитов. Однако исследование на кроликах не выявило значительного влияния такой комбинированной терапии на относительную массу легких и их морфометрию. При этом исследование на крысах показало, что нет преимуществ в использовании комбинации FETO и РК по сравнению с применением изолированно одного метода.

Не проводилось исследований на человеке, изучающих пренатальное лечение Р.К. Доказано, что избыточное введение витамина, А является тератогенным для человека. Синтетические производные витамина, А относятся к классу Х по классификации FDA [28].

Ингибиторы фосфодиэстеразы (ИФ) широко используются для лечения ЛГ в клинической практике. Это послужило причиной исследования их влияния на легкие плодов с ВДГ.

У новорожденных с ВДГ поразительно часто присутствует рефрактерная ЛГ, устойчивая к легочному вазодилататору и оксиду азота (NO). ЛГ при ВДГ связана с измененной вазореактивностью (отсутствие вазодилатации/увеличение вазоконстрикции), ремоделированием сосудов (пролиферация гладкомышечных клеток) и гипоплазией легочного сосудистого русла. Фосфодиэстеразы — это ферменты, играющие важную роль в регулировании тонуса гладкой мускулатуры [29]. Силденафил является относительно селективным ингибитором одного из этих ферментов — фосфодиэстеразы 5-го типа (ФДЭ-5). Разлагая циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), ФДЭ-5 мешает вазодилатации опосредованной NO, и, следовательно, приводит к вазоконстрикции. Ингибирование ФДЭ-5 силденафилом приводит к увеличению периода полувыведения цГМФ и, следовательно, к вазодилатации и увеличению кровотока. Силденафил также оказывает антипролиферативный эффект за счет стимуляции выработки циклического аденозинмонофосфата [30]. Именно поэтому силденафил активно применяют для лечения ЛГ у новорожденных, детей и взрослых [31—33].

Следовательно, можно предположить, что антенатальное ингибирование ФДЭ-5 силденафилом уменьшит легочные сосудистые аномалии при ВДГ.

В экспериментах на животных также использовался другой препарат из данной группы — тадалафил, который является более сильным селективным ингибитором ФДЭ-5. При сравнении лечения силденафилом и тадалафилом у новорожденных с персистирующей ЛГ не было выявлено существенных различий. К сожалению, организм новорожденного не способен адекватно метаболизировать тадалафил из-за незрелого пути глюкуронидирования, поэтому маловероятно его клиническое использование в качестве антенатальной терапии [34].

Перспективность применения ингибиторов фосфодиэстеразы, в частности силденафила еще и в том, что по сравнению с производными витамина, А они не оказывают тератогенного действия и, по имеющимся данным, безопасны для матери и плода. Антенатальное действие силденафила на материнский организм и плод оценивалось у женщин с преэклампсией, при беременности, осложненной идиопатическим олигогидроамнионом и при внутриутробной задержке роста плода в международном исследовании STRIDER (Maternal sildenafil for severe fetal growth restriction). В литературе [35—37] не сообщалось о неблагоприятных последствиях для матери и плода в случае использования при беременности данного препарата.

В настоящее время опубликованы данные нескольких исследований о влиянии силденафила на плоды животных с ВДГ [38—45].

Данный препарат связан с несколькими биомолекулярными факторами, поддерживающими вазодилатацию: он восстанавливает нарушенную при ВДГ реакцию на стимулы таких естественных вазодилататоров, как оксид азота и кислород, а также оказывает некоторое положительное влияние на развитие дыхательных путей. Влияние силденафила на относительную массу легких неоднозначно: одни авторы указывают на ее увеличение, другие — на уменьшение; несколько исследований показали отсутствие эффекта.

Наглядно результаты данных исследований представлены в таблице.

На крысиной модели продемонстрировано увеличение альвеолярного радиального счета (определяется по количеству альвеолярных перегородок, расположенных на прямой линии, которая проведена от терминальной бронхиолы к плевре или лобулярной перегородке), количества альвеол, уменьшение толщины альвеолярных перегородок, а также гипертрофии правого желудочка сердца и повышение парциального давления кислорода в крови [38—45]. На функциональном уровне кроличьи легкие, обработанные силденафилом, демонстрируют повышение общего объема легких [44].

Стероиды широко используются для ускорения созревания легких при угрозе преждевременных родов. Исходя из этого можно предположить, что антенатально примененные кортикостероиды могут улучшить развитие легких и при ВДГ.

Эффективность антенатального применения кортикостероидов при ВДГ была исследована в моделях ВДГ у крыс, кроликов и овец [46—54].

Данные исследования показывают, что кортикостероиды приводят к уменьшению толщины альвеолярных перегородок, увеличению объема воздушных пространств и альвеолярного радиального счета, но не влияют на относительную массу легких. Влияние кортикостероидов на выработку сурфактанта при ВДГ неясно. S. Mayer и соавт. [55] продемонстрировали, что пренатальный бетаметазон частично восстанавливает экспрессию мРНК сурфактанта у крыс, тогда как H. Suen и соавт. [46] не обнаружили такого эффекта.

Единственная пренатальная терапия ВДГ, по которой имеется рандомизированное контролируемое исследование на человеке — это терапия бетаметазоном (кортикостероидом), который вводили матерям внутримышечно на 34-й неделе беременности. Промежуточный анализ после 32 завершенных наблюдений (17 стероидов, 15 плацебо) не выявил различий по перинатальной смертности, длительности искусственной вентиляции легких и госпитализации у новорожденных. Исходя из этих предварительных результатов, комитет по безопасности решил досрочно прекратить исследование [56].

Глюкокортикоиды улучшают созревание легких преимущественно за счет сдерживания гиперпролиферации межальвеолярных перегородок и окружающей мезенхимы [57]. Антенатальное применение кортикостероидов улучшает вазодилатацию легочных сосудов путем увеличения экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота. Влияние их на экспрессию эндотелиального сосудистого фактора роста неоднозначно: одни исследования указывают на повышение его уровня, другие — на уменьшение. Морфологически антенатальное применение кортикостероидов увеличивает число дистальных сосудов и уменьшает их маскулинизацию [48, 51, 52].

Считается, что различные факторы роста играют важную роль в процессе легочного органогенеза.

Эпидермальный фактор роста (EGF) ускоряет развитие и созревание гипопластических фетальных легких in vitro.

Исследование на нитрофениндуцированной ВДГ у крыс подтвердило положительное влияние EGF на развитие легких при его пренатальном введении. После введения EGF значительно улучшались дифференцировка и ультраструктура пневмоцитов II типа, которые содержали многочисленные митохондрии и обильные пластинчатые тела с сурфактантом [58].

Инсулиноподобные факторы роста (ИФР) влияют на пролиферацию и дифференцировку клеток в некоторых тканях через аутокринные или паракринные механизмы. Недавние исследования на крысах показали, что ИФР вовлечены в пролиферацию и дифференцировку альвеолярных клеток [59].

Легкие плодов крыс с нитрофенинуцированной ВДГ культивировали в среде с ИФР-1 и ИФР-2. Выявлено значительное увеличение экспрессии маркеров, связанных с альвеолярными эпителиальными клетками I и II типов, в группе ИФР-2 по сравнению с контрольной группой после 48 ч культивирования. Иммуногистохимическое окрашивание показало, что морфология клеток была изменена от кубовидного до плоского типа в этой же группе [59]. Таким образом, введение ИФР-2 в гипопластические легкие может привести к вторичному созреванию [59].

Известно, что глюкогоноподобный пептид-1 (ГПП-1) стимулирует секрецию инсулина после еды. Его рецепторы (ГПП-1R) выражены не только в поджелудочной железе, но также обнаружены в легком, где они могут играть роль в стимуляции секреции сурфактанта. В модели ВДГ на крысах пренатальное введение лираглутида (агониста ГПП-1) беременным крысам увеличивало относительную массу легких и легочную морфологию, а также продукцию сурфактанта у плодов. Эти изменения привели к улучшению выживаемости новорожденных крыс с нитрофениндуцированной ВДГ [60].

Развитие легких плода связано с простагландиновым путем, где простациклин регулирует развитие и тонус легочных сосудов. Поэтому постнатальное введение таких аналогов простагландина, как эпопростенол может рассматриваться как перспективная стратегия лечения больных с ЛГ. В эксперименте доказано, что пренатальное введение аналога простациклина с замедленным высвобождением — ONO-1301 (7,8-дигидро-5Еα-3-пиридил-бензилидин-аминоокси-этил-1-нафтилоксиуксусная кислота) — предотвращает прогрессирование гипоплазии легких, связанной с ВДГ, индуцированной нитрофеном, что указывает на потенциал данного метода при легочной гипоплазии у плода [61]. ONO-1301 является синтетическим агонистом простациклина. При пренатальном введении ONO-1301 беременным крысам, у плодов которых была индуцирована ВДГ, отмечались увеличение относительной массы легких, уменьшение толщины медиальной стенки легочных артерий, увеличение количества пневмоцитов II типа и плотности капилляров, что было связано с более высокой экспрессией VEGF. Введение ONO-1301 ослабляет легочное сосудистое ремоделирование и улучшает выживаемость крыс с ЛГ, индуцированной мокроталином, в связи с повышением экспрессии VEGF, фактора роста гепатоцитов (HGF) и фактора стромальной клетки (SDF) 1-го типа [61].

В литературе появились данные о пренатальном применении в эксперименте тетрандрина (Тет), который представляет собой алкалоид бисбензилизохинолина, выделенный из корня стеаранты tetrandra, который использовался в традиционной китайской медицине. Тет дает многие фармакологические эффекты, включая антифиброзную, антигипертензивную, противовоспалительную, антиоксидантную, иммуномодулирующую и противоопухолевую активность и др. В исследованиях на плодах крыс с индуцированной нитрофеном ВДГ были продемонстрированы эффекты Тет при его пренатальном введении. Относительная масса легких была выше после введения Тет, морфология легких и ультраструктура пневмоцитов также улучшались после его введения. Механизм действия тетрандрина связывают с понижением избыточной экспрессии EGF-β₁, которая неблагоприятно сказывается на развитии легких [62].

Использование стволовых клеток является качественно новым методом лечения ВДГ, который вызвал большой интерес в течение последних нескольких лет. Есть данные об эффективности использования стволовых клеток в других моделях заболеваний легких, а именно: бронхолегочная дисплазия, острый респираторный дистресс-синдром и первичная ЛГ [63].

Существует несколько типов стволовых клеток, которые были предложены для индуцирования роста легких. В экспериментальных моделях ВДГ изучались только стволовые клетки на основе амниотической жидкости и мезенхимальные стволовые клетки (MSC) из легких взрослых крыс. Основным преимуществом использования стволовых клеток на основе амниотической жидкости являются относительная легкость и безопасность их забора, низкая иммуногенность и возможность аутологичной клеточной терапии [64].

Существует два основных подтипа стволовых клеток амниотической жидкости: мезенхимальные стволовые клетки амниотической жидкости (AF-MSCs) и CD117-позитивные амниотические стволовые клетки (AFS). В лаборатории S. Kunisaki [65] среди прочего обнаружили, что AF-MSCs можно легко изолировать из образца амниотической жидкости объемом 1—2 мл. По определению AF-MSC имеют ограниченный потенциал дифференциации, специфичный для мезодермальной линии, но они быстрее размножаются в культуре, чем MSC, а также дают потенциальный противовоспалительный эффект [66, 67].

В отличие от AF-MSC, стволовые клетки с положительными гранулами CD117 (c-kit)-AFS имеют более широкие плюрипотентные характеристики и обладают потенциалом дифференцировки трех слоев. Они не требуют специальных субстратов для поддержки их долгосрочного роста в культуре. Потенциальным преимуществом AFS-клеток является их потенциал как «готового» продукта для аллогенной инъекции. Однако этих клеток относительно мало в амниотической жидкости, особенно после 22 нед беременности. Этот вопрос, вероятно, исключает использование аутологичных клеток AFS при лечении ВДГ у плода.

Экзогенные стволовые клетки могут усилить развитие легких при ВДГ двумя различными механизмами. Во-первых, они могут обладать способностью интегрировать и дифференцироваться в легочный эпителий, сосудистые гладкомышечные клетки и другие типы клеток. Во-вторых, стволовые клетки могут оказывать свой эффект паракринным способом посредством противовоспалительного и иммуномодулирующего влияния или путем активации нативных клеток-предшественников в легких.

F. Pederiva и соавт. [68] в своем исследовании продемонстрировали, что клетки AFS как in vitro (сокультивирование с тканью легкого), так и in vivo (внутриамниотическое введение) улучшают рост легких, иннервацию и моторику бронхов в нитрофениндуцированной модели ВДГ у крыс. Причем основной терапевтический эффект, по-видимому, связан с паракринными механизмами. Среди различных факторов, которые могли бы повлиять на этот эффект, основные — это фактор роста фибробластов 10-го типа (FGF-10), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF-α) и трансформирующий фактор роста (TGF-β₁). FGF-10 имеет большое значение для морфогенеза легких. TGF-β₁, напротив, предотвращает местное почкование и ветвление проксимальных дыхательных путей, подавляя пролиферацию эпителиальных клеток. VEGF-α является промотором ангиогенеза, а также дифференциации эмбриональных мезенхимальных клеток в эндотелиальные. В данном исследовании уровни FGF-10 и VEGF-α после добавления клеток AFS были увеличены по сравнению с таковыми в контрольной группе, а уровень TGF-β₁ был сходен с этим показателем в контрольной группе [68].

R. Yuniartha и соавт. [69] исследовали влияние трансплантации мезенхимальных стволовых клеток в нитрофениндуцированной модели ВДГ у крыс. MSCs трансплантировали крысам через маточную вену. На фоне трансплантации морфология легких значительно улучшалась, уменьшалась толщина альвеолярных стенок и медиальной стенки легочных артерий увеличивались альвеолярные воздушные пространства и выработка сурфактанта.

Дискуссионным в анстоящее время остается вопрос о пути введения стволовых клеток плоду. Обсуждаются внутриамниотический, эндотрахеальный, венозный и перитонеальный пути, а также комбинация эндотрахеального введения с баллонной окклюзией трахеи.

Другими нерешенными вопросами для перевода терапии стволовыми клетками в клинику являются потенциальные иммунологические барьеры и непреднамеренное воздействие ксеногенных реагентов, которые в настоящее время используются для производства большинства стволовых клеток.

Существующий в настоящее время единственный метод пренатальной коррекции легочной гипоплазии при ВДГ — баллонная окклюзия трахеи плода — является инвазивным, трудоемким и не во всех случаях эффективным. При хирургической коррекции порока возможны некоторые осложнения, такие как преждевременные роды, неудачные попытки окклюзии трахеи, трахеомегалия у плода, которые в свою очередь могут привести к гибели плода и новорожденного, поэтому идет поиск альтернативных пренатальных стратегий. Особый интерес представляют исследования по сочетанию хирургических и нехирургических методов лечения легочной гипоплазии при ВДГ. Недавние достижения исследователей в области применения медикаментозных технологий свидетельствуют о том, что фармакологические подходы и подходы, основанные на применении стволовых клеток, могут быть перспективными относительно пренатальной коррекции легочной гипоплазии и гипертензии у плодов с ВДГ.

Несмотря на положительные результаты медикаментозной внутриутробной терапии в эксперименте на животных, применение данных стратегий в клинической практике пока не представляется возможным. Это связано и с доказанным тератогенным эффектом некоторых фармакологических агентов, например, ретиноевой кислоты и с недостаточной изученностью других, используемых на животных, препаратов. Применение стволовых клеток у человека в настоящее время ограничено иммунологическими барьерами, а также неопределенностью оптимального пути их введения.

Все это, несомненно, требует проведения дальнейших исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors declare lack of the conflicts of interests.

*e-mail: kosovcovan @ mail.ru;
https://orcid.org/0000-0002-4670-798X