В настоящее время эндометриоз обоснованно признан самым распространенным и тяжелым заболеванием женщин репродуктивного возраста, отрицательно влияющим на общее состояние, работоспособность и качество жизни больных [1-3]. Сложность и многофакторность заболевания, недостаточная изученность его патогенеза обусловливают отсутствие единого подхода к ранней диагностике и лечению эндометриоза [4-6]. В связи с этим необходимость поиска новых информативных биомаркеров для неинвазивной диагностики эндометриоза стала приоритетным направлением исследований в этой области.

Существенный прогресс в поиске специфических маркеров патологических процессов стал возможен благодаря разработке и внедрению в биомедицинские исследования протеомных технологий [7]. Протеомика позволяет оценить совокупность белков исследуемого объекта (протеом) и своевременно выявить изменения в их экспрессии. Основной задачей протеомного анализа является идентификация определенных белков или их комбинаций, которые присутствуют или отсутствуют в протеоме изучаемого объекта [8]. Протеомный анализ может дать ценную информацию о молекулярных механизмах формирования и развития эндометриоза, что позволит выдвигать аргументированные предположения о значении конкретных белков в качестве маркеров данного заболевания [9, 10].

Цель исследования - выявление специфических маркеров диагностики наружного генитального эндометриоза (НГЭ) на основании протеомного анализа.

В проспективное исследование были включены 88 пациенток репродуктивного возраста (средний возраст 29,3±0,3 года), которые были разделены на три клинические группы: 1-ю группу составили 28 больных с I-II стадиями НГЭ, 2-ю группу - 30 пациенток с III-IV стадиями заболевания, 3-ю (контрольную) группу - 30 пациенток без эндометриоза, которым проводили обследование по поводу бесплодия или стерилизацию.

Лапароскопия и гистероскопия проводились по общепринятым методикам с использованием необходимого оборудования. Оценка степени распространения НГЭ осуществлялась согласно классификации r-AFS (1996). Критерии включения пациенток в исследование: репродуктивный возраст, наличие жалоб на бесплодие и/или болевой синдром, проведение у больной эндоскопической операции (лапаро- и гистероскопия), подтверждающей НГЭ с последующей морфологической верификацией диагноза. Критериями исключения из исследования являлись возраст пациенток старше 45 лет, злокачественные новообразования. По возрасту, особенностям репродуктивной системы, соматическому и гинекологическому анамнезу пациентки основной и контрольной групп были сопоставимы.

Материалом для исследования служила перитонеальная жидкость (ПЖ), забор которой осуществляли в процессе проведения лапароскопических операций, и сыворотка крови, полученная во время дооперационного обследования.

Все клинические исследования проводились с информированного согласия больных и протоколировались по стандартам этического комитета РФ.

Протеомный анализ осуществляли с помощью высокоразрешающего двухмерного электрофореза с последующим окрашиванием белков нитратом серебра [11]. Электрофореграммы сканировали и анализировали с использованием пакета программ. Идентификацию белков, экспрессия которых значительно изменялась (белки отличия), после их трипсинолиза проводили методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии на времяпролетном масс-спектрометре с использованием опции Peptide Fingerprint программы MascotMSSearch и баз данных NCBI и Swiss-Prot. Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95% и показателе сиквенс^​*​-покрытия не менее 60%.

Содержание глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ), аполипопротеина A-IV, компонентов системы комплемента С3 и С4-b в ПЖ и сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА), используя специальные наборы.

Для оценки степени достоверности различий между сравниваемыми группами использовали критерии Манна-Уитни и Краскела-Уоллеса (программа Statistica, версия 10.0. фирмы «StatSoft. Inc.»). Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Учитывая особую роль в формировании и развитии эндометриоза процессов, происходящих на локальном уровне [12], на первом этапе исследования проводили протеомный анализ ПЖ пациенток с наиболее выраженным (III-IV стадии) НГЭ и пациенток контрольной группы.

В протеомном спектре ПЖ при эндометриозе установлено появление 4 белков: аполипопротеина А-IV, ГСПГ, компонентов С3 и С4b. Кроме того, выявлено отсутствие при рассматриваемой патологии фактора дифференцировки пигментного эпителия, транстиретина, гаптоглобина, α1-антитрипсина и ингибитора апоптоза 6.

Наибольший интерес представляют белки отличия, которые появились в протеомном профиле ПЖ при эндометриозе, поскольку именно повышенный уровень определяемого белка наиболее часто является критерием развития того или иного патологического процесса.

На втором этапе исследования определяли количественные показатели Апо-АIV, ГСПГ, С3 и С4-b в ПЖ и в сыворотке крови методом ИФА для оценки их диагностической значимости.

В ПЖ установлено повышение уровня Апо-АIV на 28% при I-II стадиях НГЭ (р=0,002) и на 24% - при III-IV стадиях (р=0,031) по сравнению с соответствующими показателями в контрольной группе (табл. 1). На системном уровне сохранялась сходная динамика содержания указанного белка. Так, cодержание Апо-АIV в сыворотке крови при I-II и III-IV стадиях НГЭ было увеличено на 15% (р=0,033) и 12% (р=0,014) соответственно по сравнению с аналогичными величинами в контрольной группе (табл. 2).

Повышение экспрессии этого белка, по-видимому, приводит к увеличению уровня липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) при эндометриозе [13]. Апо-АIV является основным структурным компонентом ЛПВП, обладающих противовоспалительными свойствами [14, 15]. Аполипопротеин A-IV оказывает антиоксидантное действие за счет ингибирования перекисного окисления липидов [16], сопровождающее развитие данной патологии. Помимо указанных функций, данный белок снижает редокс^​*​-зависимый апоптоз иммунокомпетентных клеток [17]. Этот механизм, вероятно, является компенсаторной реакцией, направленной на сохранение иммунологической защиты брюшины малого таза.

Аналогичная направленность изменений характерна и для ГСПГ, содержание которого в ПЖ повышено на 29% (р=0,031) и 41% (р=0,031) соответственно при I-II и III-IV стадиях эндометриоза (см. табл. 1).

Повышение продукции ГСПГ, регулирующего биологическую активность стероидных гормонов, может приводить к нарушению баланса между свободными и связанными эстрогенами и защищает эстрогены от катаболизма, повышая их доступность для эндометриальных клеток [18]. В результате этого создаются условия для локальной гиперэстрогении и становится возможным увеличение пролиферативного потенциала клеток эндометриоидных гетеротопий [1].

Сывороточный уровень ГСПГ относительно показателя в контрольной группе также повышается при прогрессировании заболевания: на 74% при I-II стадиях (р=0,01) и на 52% при III-IV стадиях (p=0,036) (см. табл. 2).

В ПЖ при III-IV стадиях эндометриоза отмечается повышение содержания С3 на 74% (р=0,001) по сравнению с показателем в контрольной группе, в то время как его уровень при I-II стадиях НГЭ достоверно не изменялся (см. табл. 1). Очевидно, повышение продукции перитонеальными макрофагами этого белка, участвующего в воспалительной реакции, обезвреживании апоптозных клеток и иммунных комплексов, вносит вклад в механизмы развития эндометриоза и связанного с ним бесплодия [19, 20].

Уровень компонента С3 при III-IV стадиях эндометриоза в сыворотке крови возрастает на 23% (p=0,018) по сравнению с показателями в контрольной группе (см. табл. 2). Следует отметить, что при ранних стадиях заболевания была выявлена тенденция к повышению уровня этого белка в сыворотке крови (р=0,05).

Достоверных изменений содержания компонента С4-b в сыворотке крови и ПЖ как при I-II стадиях, так и при III-IV стадиях при эндометриозе не обнаружено (см. табл. 1, 2).

Однонаправленные изменения содержания указанных белков в сыворотке крови и ПЖ свидетельствуют об общих молекулярных механизмах модификации их экспрессии как на системном, так и локальном уровнях.

С помощью протеомного анализа, позволяющего установить корреляцию между набором белков и развитием патологии, при НГЭ обнаружены изменения белкового состава ПЖ и сыворотки крови по сравнению с их контрольными спектрами. При I-II стадиях НГЭ имеется повышение уровня ГСПГ и Апо-АIV в ПЖ и сыворотке крови по сравнению с показателями контрольной группы. Для III-IV стадий заболевания характерно увеличение содержания Апо-АIV, ГСПГ и С3 в ПЖ и сыворотке крови. Модификация протеомного спектра при изученной патологии наряду с негативными последствиями лежит в основе компенсаторных реакций. Изученные белки могут быть предложены в качестве информативных маркеров для диагностики НГЭ и его стадий.