Неуклонный рост распространенности рака шейки матки (РШМ), продолжающий занимать ведущее место в структуре онкогинекологической патологии, является актуальной проблемой здравоохранения. В настоящее время ведущей в развитии РШМ общепризнана вирусная этиология, согласно которой вирус папилломы человека (ВПЧ) обладает способностью вызывать предопухолевую и опухолевую трансформацию клеток эпителия шейки матки [1, 15]. Среди онкогенных типов ВПЧ самыми распространенными являются ВПЧ 16-го и 18-го типов, на их долю приходится не менее 70% случаев РШМ в мире [14].

Известно, что за онкогенные свойства вируса отвечают онкобелки Е6 и Е7, которые угнетают действие опухолевого супрессорного белка р53 и протеина ретинобластомы pRb, что сопровождается изменениями в клеточном цикле и нарушением экспрессии белков p16ink4α и Ki-67 [2, 4, 5, 8]. Белок p16ink4α относится к ингибиторам циклинзависимых киназ, которые тормозят пролиферацию, Ki-67 является белком клеточной пролиферации и экспрессируется в течение всех активных фаз клеточного цикла, отсутствуя в клетках, находящихся в фазе G0 [2, 4, 15].

Клиническая картина и исход папилломавирусной инфекции (ПВИ) зависят не только от типа вируса, но и формы инфекции. Большинство случаев инфицирования (80-90%) заканчивается спонтанной элиминацией ВПЧ, в то время как длительное персистирование ВПЧ приводит к злокачественной трансформации клеток эпителия шейки матки [10, 14]. Для повышения эффективности прогнозирования и профилактики предопухолевых процессов в шейке матки имеют значение методы, не только направленные на определение ВПЧ, но и позволяющие установить форму течения ПВИ и объективно оценить клиническую ситуацию. В частности, для повышения качества диагностики цервикальных поражений актуальным является внедрение новых высокоинформативных диагностических методов, включая методы определения онкобелка Е7 ВПЧ и биомаркеров p16ink4α и Ki-67.

Цель исследования - оценка частоты персистирующей формы ПВИ у больных с цервикальной интраэпителиальной неоплазией (CIN) на основании определения онкобелка Е7, особенностей его взаимосвязи с белками р16ink4a и Ki-67 в зависимости от степени цервикального предрака.

Обследованы 78 пациенток с цервикальной ПВИ (ВПЧ 16-го и/или 18-го типов) в возрасте от 19 до 45 лет. Среди 58 ВПЧ-позитивных пациенток с верифицированной CIN (*SIL) выделены 2 основные группы больных: с CIN I (**LSIL) - 28 пациенток (1-я группа), CIN II-III (***HSIL) - 30 пациенток (2-я группа), в группу сравнения включены больные с латентной формой папилломавирусной инфекции (n=20); в контрольную группу - 19 здоровых женщин.

Критерии включения пациенток в основные группы: репродуктивный возраст, наличие позитивного ВПЧ-теста, гистологически верифицированный диагноз CIN I, CIN II, CIN III. Критерии включения в группу сравнения: репродуктивный возраст, наличие позитивного ВПЧ-теста, отсутствие SIL по данным цитологического исследования, отсутствие CIN по данными гистологического исследования. Критерии включения в контрольную группу: репродуктивный возраст, наличие негативного ВПЧ-теста, отсутствие патологии шейки матки. Письменное информированное согласие пациенток являлось обязательным условием для участия в исследовании.

Критерии исключения: возраст моложе 19 и старше 45 лет, беременность, наличие гормонально-зависимых заболеваний гениталий, острых воспалительных заболеваний и обострения хронических заболеваний в течение последних 6 мес, преинвазивный и инвазивный РШМ, отказ пациентки от участия в исследовании.

Комплексное обследование пациенток включало применение кольпоскопического, цитологического исследования (традиционный метод и метод жидкостной цитологии) с интерпретацией результатов по системе Betesda (2001), гистологического исследования, выявление ВПЧ высокого онкогенного риска с типированием посредством полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентной детекцией (тест-система АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-FL). При обнаружении ДНК ВПЧ 16-го и (или) 18-го типов проводили определение онкобелка Е7 в цервикальных пробах методом иммуноферментного анализа (тест-система Е7-ВПЧ-16/18-Диагност) и иммуноцитохимическое определение р16ink4α и Кi-67 в мазках (тест-система CINtec® PLUS Kit). Для обработки полученных данных использовали статистические методы (точный критерий Фишера, информационная статистика Кульбака, корреляционный анализ Спирмена).

Пациенткам с цервикальным предраком, латентной формой ПВИ и неинфицированным женщинам проводилось исследование цервикальных проб на онкобелок Е7 ВПЧ16/18 (n=97). Онкобелок Е7 в сравниваемых группах определялся с различной частотой (2I=41,38; p<0,001). При детализации различий установлено: у больных с ВПЧ-ассоциированными плоскоклеточными поражениями позитивный тест на наличие Е7 отмечен в 1-й (64,3±9,06%) и 2-й (83,3±6,80%) группах, что было статистически значимо по сравнению с контрольной группой (р=0,000), в которой наблюдались исключительно негативные результаты (см. рисунок).

Проведен сравнительный анализ латентной и клинической форм ПВИ. Нами не установлены различия по частоте обнаружения Е7 при сравнении основных групп больных (р=0,09). Однако, если в 1-й основной группе повышение частоты выявления Е7 относительно группы сравнения не являлось статистически значимым, то во 2-й основной группе такое преобладание Е7 носило значимый характер (р=0,01).

При проведении корреляционного анализа по Спирмену установлена прямая средней силы статистически значимая корреляционная связь между степенью CIN и частотой выявления онкобелка Е7 (r_s=+0,45; р<0,001).

Итак, для больных с ВПЧ-ассоциированной CIN II-III степени характерна более высокая частота обнаружения онкобелка Е7 ВПЧ, чем у инфицированных больных с низкой степенью плоскоклеточного интраэпителиального поражения и у пациенток с латентной инфекцией, что свидетельствует о большей распространенности персистирующего течения ПВИ при высокой степени поражения шейки матки.

Полученные данные согласуются с данными других исследователей, установивших повышение экспрессии онкобелка Е7 у женщин с CIN, более выраженное при CIN III и РШМ [3, 6, 11]. По данным Н.П. Евстигнеевой [3], у женщин с персистирующей ПВИ в сочетании с интраэпителиальной неоплазией и РШМ экспрессия онкобелка Е7 регистрируется наиболее часто (в 73,5% случаев), а персистирующее течение ПВИ сопровождается экспрессией онкобелка Е7 в 10,4 раза чаще, чем транзиторное течение (27,1% против 2,6%). Экспрессия онкобелка Е7 у пациенток с предраком увеличивается от 66,7±12,2% при LSIL до 82,4±5,2% при HSIL [6].

При сравнении результатов кольпоскопического исследования у пациенток основных групп установлено, что аномальные кольпоскопические признаки и их выраженность доминировали у больных с ВПЧ-ассоциированными HSIL: ацетобелый эпителий (φ=0,1052; р=0,001), мозаика (φ=0,1667; р=0,0000), пунктация (φ=0,0858; р=0,0032) и атипичные сосуды (φ=0,0625; р=0,01) встречались достоверно чаще в сравнении с аналогичными признаками у пациенток 1-й группы.

Цитологические образцы подвергались иммуноцитохимическому исследованию на наличие экспрессии p16ink4α и Ki-67. При позитивной реакции оценивалась количественная составляющая экспрессии (диффузная и фокальная) в виде единичных клеток и гиперэкспрессии р16, Ki-67, а также производилась оценка коэкспрессии p16ink4α и Ki-67 (см. таблицу).

При определении экспрессии Ki-67 отмечено преобладание этого маркера во 2-й группе (группе больных с высокой степенью плоскоклеточного интраэпителиального поражения) по сравнению с его экспрессией у больных 1-й группы, группы сравнения (р=0,003; р=0,005) и контрольной группы, в которой не зарегистрировано наличие Ki-67 (р=0,001). При определении коэкспрессии биомаркеров p16ink4α и Ki-67 установлено доминирование этих маркеров у пациенток 2-й группы относительно больных 1-й группы, группы сравнения и контрольной группы (р=0,003, р=0,005 и р=0,001 соответственно).

При проведении корреляционного анализа по Спирмену установлена прямая средней силы корреляционная связь между степенью CIN и р16 (r_s=+0,43; р<0,001), между степенью CIN и Ki-67 (r_s=+0,38; р<0,001), а также между степенью CIN, р16 и Ki-67 (r_s=+0,38; р<0,001).

У больных с персистирующей ПВИ (позитивный тест на Е7) характер экспрессии биомаркеров имел следующие особенности. Экспрессия р16 доминировала во 2-й группе относительно таковой в 1-й группе (р=0,05), в группе сравнения (р=0,01) и контрольной группе (р=0,0001). В 1-й группе больных, позитивных по Е7, экспрессия р16 наблюдалась достоверно чаще, чем у женщин контрольной группы (р=0,02). Экспрессия Ki-67 у Е7-позитивных лиц также преобладала при HSIL (2-я группа) по сравнению с таковой в 1-й группе, группе сравнения и контрольной группе (р=0,007, р=0,009 и р=0,003 соответственно). При оценке коэкспрессии маркеров p16ink4α и Ki-67 у Е7-позитивных женщин установлены аналогичные статистически значимые изменения. Полученные данные свидетельствуют о более высокой экспрессии онкопротеинов р16 и Ki-67 при CIN II-III на фоне персистирующей инфекции, чем при CIN I, при которой характер экспрессии биомаркеров не имеет различий с таковым при латентной инфекции.

Определены чувствительность, специфичность и прогностическая ценность положительного результата онкомаркеров p16ink4α и Ki-67 при CIN. Для биомаркера p16ink4α диагностическая чувствительность составила 55,5%, диагностическая специфичность - 83%, а прогностическая ценность положительного результата - 88%. Для маркера пролиферации Ki-67 диагностическая чувствительность составила 32,2%, диагностическая специфичность - 94%, а прогностическая ценность положительного результата - 92,3%. Оценка коэкспрессии p16ink4α и Ki-67 показала диагностическую чувствительность 42,2%, диагностическую специфичность - 93,6% и прогностическую ценность положительного результата - 92,1%.

Таким образом, нами установлено, что детекция онкомаркера р16 и маркера пролиферации Ki-67 при ПВИ зависит от степени тяжести цервикального плоскоклеточного интраэпителиального поражения. В серии предыдущих исследований было показано значение определения биомаркера р16 при CIN [2, 7-9], Ki-67 по мере прогрессирования неопластического процесса в шейке матки [12, 13]. По данным Г.А. Раскина и соавт. [7], которые оценивали ядерную и ядерно-цитоплазматическую реакцию р16, частота его экспрессии увеличивалась пропорционально степени поражения от CIN I до рака. По данным С.И. Роговской и соавт. [8], проводивших изучение молекулярных маркеров иммуногистохимическим методом, чувствительность р16 при CIN составила 81-95%, специфичность - 95-100%, при высокой информативности для Ki-67 (98,4 и 97,8% соответственно).

В свою очередь опубликованы лишь единичные исследования, посвященные анализу одновременного выявления биомаркеров, что было проведено в нашем исследовании в зависимости от степени поражения шейки матки. По данным H. Ikenberg и соавт. [12], детекция симультанной (совместной) гиперэкспрессии р16 и Ki-67 является индикатором наличия CIN. В проспективном исследовании, проведенном в ряде европейских стран, показана высокая чувствительность (90,1%) метода двойного определения биомаркеров для детекции CIN II по сравнению с РАР-цитологией (66,4%). По данным D. Schmidt и соавт. [13], проводивших сочетанное исследование биомаркеров p16ink4α и Ki-67 методом иммуноцитохимии при ASCUS (атипичные клетки плоского эпителия неопределенного значения) и LSIL, установлена высокая чувствительность в случае наличия LSIL (94,2%) при низкой специфичности (68%).

Полученные нами данные свидетельствуют о необходимости более широкого использования неинвазивного определения маркеров Е7, р16 и Ki-67 при первичном скрининге, что позволит усовершенствовать тактику ведения больных с цервикальным предраком. Персистирующее течение ПВИ у больных с CIN I при наличии признаков коэкспрессии p16 и Ki-67 диктует нецелесообразность наблюдательной тактики ведения больных с этой патологией. Подлежит обсуждению вопрос о более тщательном наблюдении больных с латентной формой персистирующей ПВИ.

1. У больных с CIN, ассоциированной с ВПЧ, установлены следующие особенности: более частое наличие персистирующей формы ПВИ (83,3%), корреляционная связь между степенью CIN и экспрессией онкобелка E7, гиперэкспрессия биомаркеров p16ink4α и Ki-67 при CIN II-III по сравнению с этими показателями при CIN I.

2. У больных с цервикальным предраком на фоне персистирующей ПВИ наблюдается статистически значимое повышение коэкспрессии p16ink4α и Ki-67 при CIN II-III в отличие от таковой при CIN I и при латентной форме инфекции.

3. Внедрение новых диагностических технологий раскрывает перспективы усовершенствования цервикального скрининга и лечебных подходов при этой патологии.