Одной из основных медико-социальных проблем в Российской Федерации является низкая рождаемость, связанная с репродуктивной дисфункцией. При этом репродуктивные расстройства не всегда поддаются успешной терапии. В последнее время в качестве одной из причин развития бесплодия идентифицированы нарушения ангиогенеза как на ранних стадиях фолликулогенеза, так и при селекции доминантного фолликула и созревания овоцита [6].

Изучение особенностей ангиогенеза в процессе роста и созревания фолликулов позволяет разобраться в причинах репродуктивной дисфункции женщин и выявить дополнительные резервы для повышения эффективности современных методов восстановления фертильности в программах вспомогательных репродуктивных технологий [1, 11, 30].

Ангиогенез является одним из важнейших процессов физиологического моделирования, необходимого для формирования и развития полноценного доминантного фолликула [42]. В женской репродуктивной системе постоянно происходят циклический рост и развитие новых сосудов. В процессе развития фолликула и последующего образования желтого тела в текаклетках яичника формируется сосудистая система. Дополнительные сосуды могут формироваться в месте разорвавшегося фолликула [4, 29, 36, 38].

Процесс ангиогенеза регулируется действием целого ряда таких факторов роста, как эндотелин, сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР), фактор роста фибробластов (ФРФ), фактор роста плаценты (ФРП), ангиопоэтин, тромбоспондин, ангиостатин, которые обеспечивают сохранность менструального цикла и стабильный кровоток в сосудах репродуктивной системы женщины. При этом непосредственный контроль процесса образования новых капилляров осуществляется благодаря скоординированному действию индукторов и ингибиторов ангиогенеза [2]. В нормальных условиях секреция тканевых ингибиторов ангиогенеза доминирует над индукторами [7, 19, 22, 32].

В табл. 1

Необходимо отметить, что в процессе фолликулогенеза наименее изученным является такой фактор, как эндотелин. Вместе с тем постоянным «спутником» эндотелина в процессе фолликулогенеза является СЭФР. Указанные маркеры позволяют оценить степень нарушения системы кровоснабжения фолликулов на разных стадиях их развития.

Формирование сосудистой сети имеет сходные временные рамки с активным ростом и преобладанием доминантного фолликула [36]. Это обстоятельство имеет первостепенное значение для диагностики патологических состояний, связанных с развивающимся бесплодием и использованием таких значимых маркеров ангиогенеза, как СЭФР и эндотелин.

Как нам представляется, ангиогенез следует рассматривать через призму стадий, составляющих данный физиологический процесс.

Классификация (Pedersen & Peters, 1968) развернуто отражает картину основных морфологических событий в ходе развития фолликула: инициация роста овоцита, пролиферация гранулезных и слоя текаклеток, формирование антрального фолликула. На представленном ниже рисунке

Развитие фолликула в репродуктивном периоде женщины имеет ряд особенностей и претерпевает следующие стадии развития. Стадия примордиального роста - единичный овоцит частично или полностью окружен несколькими упорядоченными клетками гранулезы, размер фолликула 30-40 мкм. У человека такие фолликулы обнаруживаются на 4-м месяце развития эмбриона. Стадия первичного роста - овоцит окружен одним слоем кубических клеток гранулезы. Стадия раннего вторичного роста - два полных слоя клеток гранулезы, размер фолликула составляет около 50 мкм. Стадия преантрального роста - овоцит увеличивается в объеме, его окружают несколько слоев клеток гранулезы, размер фолликула около 100 мкм. Стадия антрального роста - образуется полость, окруженная клетками гранулезы и заполненная фолликулярной жидкостью, количество ее возрастает по мере созревания фолликула, размер фолликула более 0,2 мм в диаметре. Каждый из антральных фолликулов в этой стадии развития обладает индивидуальной чувствительностью к ФСГ, что определяется наличием и количеством рецепторов к ФСГ в клетках гранулезы [18].

Важно отметить, что инициация васкуляризации начинается в текаклетках. Примордиальные (первичные) фолликулы получают необходимые вещества и кислород путем пассивной диффузии из клеток стромы. Формирование индивидуальной капиллярной системы вокруг каждого фолликула является обязательным и неотъемлемым процессом для его дальнейшего развития [14, 21, 36].

Формирование капиллярной сети на этапах фолликулогенеза имеет ряд особенностей. На стадии примордиального роста капиллярная сеть выглядит тонкой с неровными границами и представлена единственным слоем. Она окружена слоем текаклеток и слоем гранулезных клеток. В таком виде капиллярная сеть остается на всем протяжении процесса фолликулогенеза [14, 19, 32].

Инициация формирования капиллярной сети в гранулезных и текаклетках происходит под действием СЭФР, в то время как формирующаяся структурная и функциональная полноценность васкулярной системы требует координированного действия целого комплекса факторов. В экспериментах на крупном рогатом скоте было показано, что ангиопоэтин не обнаруживается в клетках теки до антральной стадии развития фолликула, а введение СЭФР в циклах стимуляции способствует развитию вторичных фолликулов [20, 36].

Обращаясь к преантральной стадии фолликулогенеза, необходимо отметить, что плотность сосудов капиллярной системы преантрального фолликула в этот период значительно увеличивается. Отмечено, что до 40% всех пролиферирующих клеток теки составляют эндотелиальные клетки. Для преантрального фолликула также характерна значительная экспрессия матричной РНК (мРНК) СЭФР в гранулезных и текаклетках. На данной стадии развития наблюдается положительная корреляция между степенью пролиферации и областью васкуляризации. Возможно, что последующая селекция преантральных фолликулов связана со степенью васкуляризации [19, 21, 36, 39].

На антральной стадии развития фолликула его васкулярная оболочка состоит из двух капиллярных сетей - внутренней (основной мембраны) и наружной (текальной). Неоваскуляризация важна для роста антрального фолликула, а также доминирования преовуляторного фолликула. Выбор лидирующего фолликула зависит от качества его кровоснабжения и функционирования капилляров. Каждый зрелый фолликул обладает разветвленной системой кровоснабжения. Таким образом, доминантный фолликул характеризуется обширной васкуляризацией и высокой концентрацией СЭФР [21, 36].

Практическая значимость рассматриваемых процессов прослеживается в работе Д.А. Ниаури и соавт. [6], которыми было отмечено, что нарушения менструального цикла и функциональное бесплодие характеризуются изменением кровоснабжения яичников и матки. В своем исследовании авторы провели оценку гемодинамических параметров репродуктивной системы женщины при различных формах овариальной недостаточности, включая гиперпролактинемию и овариальную гиперандрогению. Исследование кровотока в яичниках в период селекции предполагаемого доминантного фолликула из когорты синхронизированных фолликулов показало усиление кровотока в строме яичника с доминантным фолликулом у здоровых женщин. Достоверных различий параметров кровотока в яичнике, содержащем доминантный фолликул, при разных видах овариальной недостаточности не было выявлено. Нарушение процесса васкуляризации, по мнению этих исследователей, является ключевой причиной развития овариальной недостаточности, приводящей к ослаблению функции лидирующего фолликула в процессе фолликулогенеза и дальнейшим затруднениям неоангиогенеза желтого тела [6].

СЭФР (гепаринсвязывающий гликопротеин) выступает как ключевой ангиогенный маркер, и ему отводится значительная роль в регуляции фолликулярного ангиогенеза, также необходимо отметить его способность к инициированию данного процесса и пролиферации клеток фолликула. Действие СЭФР имеет несколько аспектов, что обусловлено существованием его 5 изоформ с различными биохимическими свойствами (см. табл. 1). По данным литературы, мРНК рассматриваемого фактора впервые обнаруживается в тека- и гранулезных клетках зрелых вторичных фолликулов, но отсутствует в первичных и ранних вторичных фолликулах [3, 19, 44].

Экспрессия изоформ СЭФР различна в процессе фолликулогенеза. Так, матричная РНК СЭФР₁₆₅ экспрессируется в гранулезных клетках крупного рогатого скота и не зависит от концентрации эстрадиола, но находится в прямой зависимости от концентрации прогестерона. Противоположный эффект данные стероиды оказывают на экспрессию мРНК СЭФР₁₂₁. Такое явление возможно в силу оказания рецепторами СЭФР - нейрофилином-1 и нейрофилином-2 - различного эффекта на изоформы данного фактора [31, 43]. Известно, что СЭФР₁₂₁ не способен связываться нейрофилином-1 в силу низкой митогенной активности; мРНК нейрофилина-1 присутствует в гранулезных и текаклетках, а мРНК нейрофилин-2 экспрессируется только в слое текаклеток. В эксперименте на клетках гранулезы крупного рогатого скота было показано, что секреция нейрофилина-1 регулируется прогестероном и эстрадиолом. Более того, авторы большинства работ отмечают локализацию этого фактора в васкулярной зоне гранулезных клеток [10, 12, 37].

Биологические эффекты СЭФР значительно модулируются скоординированным действием других ангиогенных маркеров (ангиопоэтин, ФРФ, ФРП). Концентрация фактора роста фибробластов 2-го типа заметно увеличивается на заключительной стадии развития фолликулов у крупного рогатого скота, а максимальная концентрация тромбоспондина и его рецептора CD36 обнаруживается в малых антральных фолликулах. Таким образом, предполагается, что регуляция тромбоспондином может играть ключевую роль в фолликулярной атрезии путем ингибирования ангиогенеза. Экспрессия данного ангиогенного маркера увеличивается под действием ЛГ в гранулезных клетках крыс и присутствует на ранних стадиях формирования желтого тела [9, 19, 35].

Характер ангиогенеза, определяемый синтезом ангиогенных факторов роста и их рецепторов, является не единственным параметром, определяющим состояние кровоснабжения фолликула на каждой отдельной стадии развития, поскольку во многом этот процесс зависит также от свойств эндотелия и баланса эндотелиальных факторов, контролирующих тонус сосудов [15]. Эндотелины плазмы крови оказывают влияние на различные физиологические и патологические процессы во многих тканях и органах, а увеличение их концентрации можно использовать в качестве маркеров патологических процессов в организме человека [16, 24, 45, 27, 41]. Эндотелиальные клетки выстилают внутреннюю поверхность сосудов, эндотелий формирует барьер между кровью и гладкой мускулатурой сосудов и функционирует в качестве модулятора функций сосудов. Под контролем эндотелина происходит регулирование сосудистого тонуса, гемостаза, транспорта липидов и иммунной реактивности [8, 17, 28, 34].

Для выяснения физиологической роли эндотелина фолликулярной жидкости в динамике развития фолликулов при эндокринном бесплодии и оценки влияния указанного маркера на величину пула малых антральных фолликулов, их рост и селекцию доминантного фолликула необходимо рассмотреть особенности химического строения эндотелина.

Семейство эндотелинов представлено четырьмя эндотелиновыми пептидами, имеющими сходную химическую структуру. Хорошо изученными являются эндотелин-1 (ЭТ-1), эндотелин-2 (ЭТ-2) и эндотелин-3 (ЭТ-3). Эндотелин-2 отличается от эндотелина-1 двумя аминокислотными остатками в структуре N-концевого участка, а эндотелин-3 и эндотелин-1 различаются шестью аминокислотными остатками. Сходство аминокислотной последовательности позволяет выдвинуть гипотезу об общности происхождения групп молекул эндотелинов [8, 25, 45].

Синтез эндотелина заключается в последовательном отщеплении олигопептидных фрагментов у неактивного предшественника препроэндотелина, после чего он превращается в активную форму. В свою очередь препроэндотелин человека состоит из 212 аминокислотных остатков, а N-концевой участок характеризуется наличием гидрофобной последовательности, назначением которой, как предполагают, является транспорт данного предшественника через мембрану клеточного ядра для последующих его превращений [5, 23, 28, 46].

В табл. 2

В табл. 3

Рецепторы эндотелина экспрессируются не только на начальной стадии процесса формирования доминантного фолликула, но и в период овуляции как в гранулезных, так и в текаклетках. В период овуляции в гранулезных клетках обнаруживаются высокие концентрации эндотелина-2 [13, 25, 26, 33, 40]. При этом наблюдаются экспрессия эндотелина-1 в гранулезных клетках яичников человека и проявление данного фактора иммунореактивности в фолликулярной жидкости, полученной у женщин при индукции суперовуляции в лечебных циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В полученной фолликулярной жидкости уровень эндотелина-1 выше в гонадотропинстимулированных циклах по сравнению со спонтанными циклами. В ходе экспериментов [13] была доказана экспрессия эндотелиновых рецепторов типов А и В (ЭТ_А и ЭТв) в яичниках человека, причем наблюдали ЭТВ в гораздо более высокой концентрации, чем ЭТ_А.

ЭТ_А и ЭТв имеют высокую экспрессию в период формирования кровеносной системы яичников. В овуляторном фолликуле отмечали концентрацию большого количества рецепторов к ЭТ_А, локализованных в theca interna. В качестве контроля использовались яичники крыс, в которых была обнаружена значительная экспрессия рецепторов к ЭТ_В в предоминантных фолликулах, локализованных в гранулезных клетках. Был сделан вывод о том, что рецепторы к ЭТ_В отрицательно регулируют накопление эстрадиола в гранулезных клетках крыс. В яичниках человека в гранулезных и лютеиновых клетках оба рецептора также не влияют на секрецию эстрадиола и прогестерона [25].

Интересно проанализировать исследование M. Zhao и соавт. [46]. Они сделали вывод о возможном влиянии концентраций СЭФР, оксида азота, эндотелина-1 фолликулярной жидкости на благоприятный исход манипуляций ЭКО. Ранее было доказано, что число антральных фолликулов или размер развивающихся фолликулов может играть прогностическую роль в прогнозировании ответа на суперовуляцию в циклах ЭКО [46]. Таким образом, целью работы стало исследование взаимозависимости между концентрацией СЭФР, оксида азота, эндотелина-1 фолликулярной жидкости и числом антральных фолликулов, обеспечивающих более точное прогнозирование наступления беременности. В исследовании принимала участие 131 женщина с бесплодием. Среди них 39 пациенток имели первичное бесплодие, и у 92 пациенток диагностировано вторичное бесплодие. Возраст женщин варьировал от 25 до 35 лет, средний возраст составил 30 лет. Женщины страдали бесплодием от 2 до 15 лет. У пациенток было подтверждено отсутствие симптомов эндометриоза, кист яичников, синдрома поликистозных яичников. Контроль стимуляции овуляции осуществлялся на 2-6-й дни. Стимуляцию проводили антагонистом гонадотропин-рилизинг гормона (трипторелином в суточной дозе 0,1 мг), а через 3 дня женщинам вводили рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (пурегон, 75 МЕ). Рекомбинантный хорионический гонадотропин вводили в момент достижения диаметра 16-18 мм как минимум тремя фолликулами (овитрель). Концентрация эстрадиола в сыворотке на момент введения овитреля превышала 2000 пмоль/л. Через 36 ч была проведена аспирация овоцитов [46]. Результаты исследований M. Zhao и соавт. показали, что содержание СЭФР и оксида азота в фолликулярной жидкости антральных фолликулов через 36 ч после введения хорионического гонатропина значительно увеличивалось у женщин с наступившей беременностью по сравнению с таковым у женщин, у которых беременность не наступила (p<0,05). Концентрация эндотелина-1 была немного ниже у 1-й группы женщин по сравнению с таковой во 2-й группе (p<0,05) [46].

Таким образом, СЭФР идентифицирован как ангиогенный и васкулярный фактор, способствующий секреции и аккумулированию антральной жидкости; оксид азота - как модулятор преобразований овоцита и регулятор формирования капиллярной сети, а ЭТ-1 - как потенциальный вазоконстриктор [46]. Представленные данные о комбинировании измерений овариального объема или количества антральных фолликулов и таких факторов, как СЭФР, оксид азота, ЭТ-1, дают возможность прогнозировать результат лечебных циклов ЭКО.

Присутствие рассматриваемого фактора в фолликулярной жидкости у женщин, включенных в лечебный цикл ЭКО и подвергающихся индукции суперовуляции, показывает степень вовлечения эндотелиновой системы в процесс фолликулогенеза человека. Данное обстоятельство демонстрирует значительную практическую значимость исследований эндотелинов в динамике развития фолликулов при эндокринной патологии.

Возрастающее число исследований в области ангиогенеза как такового и ангиогенных факторов роста, в частности, подтверждает, что физиологический ангиогенез является одним из ключевых процессов в репродукции человека. В настоящее время можно считать доказанным, что дисфункция процесса ангиогенеза может рассматриваться как один из ключевых патофизиологических факторов, обусловливающих развитие заболеваний репродуктивной системы человека. Понимание этого аспекта применительно к фолликулогенезу открывает новые перспективы в разработке методов диагностики и лечения репродуктивных расстройств и позволит определить новые направления терапевтических воздействий в будущем.