Список сокращений

µm — микрометры

µm² — квадратные микрометры

Введение

По данным отечественных и зарубежных авторов, состояние мягких тканей в области дентальных имплантатов имеет важное значение для профилактики развития осложнений не только воспалительного характера (мукозит, периимплантит), а также эстетических нарушений (просвечивание супраструктуры, недостаточный объем мягких тканей, отсутствие межзубного сосочка). В этой связи наиболее важными параметрами мягких тканей, которые необходимо учитывать, являются ширина зоны кератинизированной прикрепленной слизистой оболочки, а также горизонтальная и вертикальная толщина мягких тканей в области имплантатов [1—3].

В большинстве случаев увеличение объема мягких тканей в области дентальных имплантатов требует использования либо аутогенных трансплантатов слизистой оболочки, либо их заменителей [3, 4]. Использование аутогенных трансплантатов до сих пор считается золотым стандартом [1, 4, 5]. Однако при трансплантации аутогенных тканей возможен риск кровотечений, инфицирования или некроза донорского участка, а также продолжающийся болевой синдром [6]. В качестве альтернативы аутотрансплантатам представлены ксеногенные коллагеновые матриксы и аллогенные дермальные матрицы [1, 7]. Авторы большинства клинических и лабораторных исследований пришли к выводу, что оптимальной альтернативой аутогенным трансплантатам мягких тканей могут считаться именно ксегогенные коллагеновые матриксы благодаря своей биосовместимости, полной биодеградации и замещению материала нативной тканью [4, 6, 8].

На сегодняшний день проведено множество исследований, посвященных проблеме дефицита ширины кератинизированной прикрепленной слизистой в области имплантатов и методов коррекции этого состояния, в том числе и с использованием заменителей мягких тканей аллогенного и ксеногенного происхождения [9, 10]. Однако работы, посвященные методам увеличения толщины мягких тканей в области дентальных имплантатов, встречаются гораздо реже. Большинство подобных работ демонстрируют только клиническую эффективность используемых материалов, без подробного описания качественных характеристик полученных тканей. Более детальное изучение именно гистологического строения мягких тканей в области дентальных имплантатов и их морфометрических характеристик после проведенной мягкотканной аугментации дает возможность выбрать оптимальный вариант лечения для конкретной клинической ситуации, что и послужило причиной более глубокого изучения данной проблемы.

Материал и методы

В хирургическом отделении стоматологической клиники частного профиля и на базе кафедры хирургической стоматологии Института стоматологии им. Е.В. Боровского Первого МГМУ им. И.М. Сеченова были обследованы и прооперированы 30 пациентов с диагнозом «частичное отсутствие зубов», у которых был выявлен дефицит толщины мягких тканей с вестибулярной поверхности в области планируемой установки дентальных имплантатов, что являлось показанием для ее увеличения. Все пациенты методом случайной выборки были распределены на две группы в зависимости от используемого метода увеличения толщины мягких тканей: в 1-й группе (n=15) проводилась пересадка свободного соединительнотканного трансплантата (ССТ) из области бугра верхней челюсти, во 2-й группе (n=15) использовался коллагеновый матрикс. В исследование были включены 21 женщина и 9 мужчин в возрасте от 25 до 59 лет. Средний возраст пациентов в обеих группах составил 38,6 лет (38,67±4,88; 38,67±6,99 по группам соответственно). По гендерно-половому и возрастному признакам обе группы были сопоставимы.

Операцию выполняли стандартным образом: проводили разрез по вершине альвеолярного гребня в пределах дефекта, откидывали полнослойный слизисто-надкостничный лоскут, по стандартному протоколу устанавливали дентальный имплантат. Далее у пациентов 1-й группы проводили забор свободного соединительнотканного трансплантата с бугра верхней челюсти и фиксировали трансплантат при помощи горизонтального П-образного шва к вестибулярному слизисто-надкостничному лоскуту. У пациентов 2-й группы аналогичным образом фиксировали фрагмент коллагенового матрикса.

Далее пациентам обеих групп выполняли мобилизацию слизисто-надкостничного лоскута с последующим ушиванием раны наглухо без натяжения простыми узловыми швами. Назначали стандартную антибактериальную и противовоспалительную терапию в сочетании с использованием местных антисептиков для ежедневного ухода в раннем послеоперационном периоде.

Через 3 мес после проведенного вмешательства, на этапе установки формирователей десны, в области предполагаемого раскрытия дентальных имплантатов при помощи мукотома провели забор фрагмента мягких тканей в области ранее проведенного увеличения толщины слизистой оболочки.

Фрагменты слизистой оболочки фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина. Далее образцы дегидратировали и заливали в парафиновые блоки по общепринятой методике.

Из всех образцов в ходе микротомии изготавливали поперечные срезы толщиной 4 µm, которые депарафинировали и затем регидратировали в батарее спиртов. Далее срезы окрашивали с различными гистологическими красителями: гематоксилином и эозином, пикросириусом красным, толуидиновым синим. Окрашенные срезы заключали в синтетическую среду «Shandon mount» (США).

Готовые препараты изучали и фотографировали с помощью микроскопа «LEICA DM4000 B LED» с цифровой видеокамерой «LEICA DFC7000 T», а также программным обеспечением «LAS V4.8» (Leica Microsystems, Швейцария). В исследовании применяли как обычную световую микроскопию (микроскопию в светлом поле), так и поляризационную микроскопию — для оценки содержания коллагеновых волокон в препаратах, окрашенных пикросириусом красным.

В ходе морфометрического исследования микрофотографий с использованием лицензионной программы Adobe Photoshop CS6 проводилась количественная оценка характеристик эпителиального пласта, относительной длины базальной мембраны (соотношение абсолютной длины базальной мембраны с длиной эпителиального пласта), характеристик подлежащей соединительной ткани.

Полученные в программе Adobe Photoshop CS6 результаты морфометрии длины/толщины и площади переводили из пикселей в микрометры (µm) и квадратные микрометры (µm²) с использованием следующих коэффициентов: 0,42 и 0,65 соответственно.

Расчеты большинства из указанных морфометрических показателей на микрофотографиях биоптата проводили по формулам:

1) Формула расчета относительной площади (истинной средней толщины) изучаемых структур:

A[µm]=a/a`

где A — изучаемый показатель расчета относительной площади (в µm); а — показатель абсолютной площади (в µm2) исследуемой структуры на микрофотографии; a` — абсолютная длина (в µm) исследуемой структуры на микрофотографии.

2) Формула расчета относительного количества исследуемых структур на 1 µm длины:

B [структур/µm]= b/b`

где B — изучаемый показатель расчета относительного количества исследуемых структур [структур/µm]; b — абсолютное количество исследуемых структур на микрофотографии; b` — длина (в µm) исследуемой структуры на микрофотографии.

3) Формула расчета относительного количества исследуемых структур на 1 µm² площади:

C [структур/µm2]= c/c`

где C — изучаемый показатель расчета относительного количества исследуемых структур; с — абсолютное количество исследуемых структур на микрофотографии; c` — абсолютная площадь (в µm²) исследуемой структуры на микрофотографии.

4) Формула расчета соотношения исследуемых структур (количество/количество, длина/длина, площадь/площадь):

D=d/d`

где D — изучаемый показатель расчета соотношения исследуемых структур; d — абсолютные показатели количества/длины/площади исследуемых структур на микрофотографии; d` — другие абсолютные показатели количества/длины/площади исследуемых структур на микрофотографии.

5) Формула расчета среднего арифметического:

E = (e1 +e2 +… en)/n

где E — изучаемый средний показатель; e — соответствующий морфометрический показатель; n — количество проводимых измерений.

Остальные показатели (минимальные и максимальные значения) рассчитывались исходя из всех значений в двух изображениях (на каждый биоптат выбиралось минимальное/максимальное из двух микрофотографий значение).

Статистический анализ

Подготовку и статистическую обработку данных результатов морфометрии проводили в программах Graphpad Prism v9.0, MS Excel 2019 г. Различия средних или медиан сравнивали при помощи т-теста Стьюдента или U-теста Манна—Уитни, при нормальном распределении остатков применяли параметрический тест, в противоположном случае непараметрический. Внутри групп были рассчитаны коэффициенты корреляции Спирмена для пар переменных. Данные представлены как график «скрипка», точками указаны данные, пунктирные линии — 25, 50, 75 квантили. Статистическая значимость была принята при значении p<0,05.

Результаты исследования

При гистологическом исследовании слизистая оболочка биоптатов десны в обеих группах была выстлана многослойным плоским эпителием разной толщины, который был отграничен от сосочкового слоя базальной мембраной (рис. 1, 2). Под сосочковым слоем определялся сетчатый слой с более компактным расположением коллагеновых волокон.

Рис. 1. Общий план строения слизистой биоптатов в обеих группах.

Участки ороговения многослойного плоского эпителия слизистой отмечены красными звездочками; желтые звездочки указывают на скопления клеток зернистого слоя в ороговевающей слизистой, черные стрелки — на интраэпителиальные лейкоциты; микроскопия в светлом поле, окраска гематоксилином и эозином, ×100.

Рис. 2. Эпителий с подэпителиальными отделами биоптатов слизистой в обеих группах.

В препаратах отмечается неравномерная воспалительная инфильтрация (черными стрелками отмечены интраэпителиальные лейкоциты, красными звездочками (*) — скопления клеток воспалительного инфильтрата в соединительной ткани); желтые стрелки — фигуры митозов в базальном слое эпителия, микроскопия в светлом поле, окраска гематоксилином и эозином, ×400.

Глубокие отделы многослойного плоского эпителия были представлены базальным и шиповатым слоями, которые нередко формировали гребни, вдающиеся вглубь сосочкового слоя. В этих участках многослойный плоский эпителий имел значительную толщину. В то же время, сосочковый слой формировал выросты, направленные к поверхности эпителиального пласта, — соединительнотканные сосочки. Толщина эпителиального пласта в таких участках была незначительной. Количество гребней и сосочков в 1-й и во 2-й группах отличалось значительной вариабельностью, что, в свою очередь, также способствовало значительной вариабельности толщины эпителиальных пластов в биоптатах слизистой.

Кроме того, и гребни, и сосочки придавали базальной мембране неровный контур и значительную длину, значительно превышающую длину эпителиального пласта, что увеличивало площадь соприкосновения эпителия и подэпителиальных отделов слизистой.

При более детальном исследовании поверхностных отделов эпителиальных пластов также обнаруживались различные способы созревания эпителия (см. рис. 2). Так, в одних участках слизистой признаки ороговения отсутствовали и наиболее зрелые слои были представлены промежуточным и поверхностным слоями, в то время как другие участки характеризовались значительно развитым зернистым и роговым слоем. При этом слизистая ороговевала как ортокератозом (без наличия ядер в роговых массах), так и паракератозом (с многочисленными пикнотичными ядрами в роговом слое), без четких границ между указанными участками эпителия. Данные изменения наблюдались как в 1-й, так и во 2-й группе.

Характерный для ороговевающей слизистой зернистый слой был также развит неравномерно (см. рис. 1): нередко его клетки располагались в виде очагов или отсутствовали вовсе — тогда шиповатый слой напрямую переходил в промежуточный и далее — в ороговевающий.

В слизистой оболочке также отмечалась неравномерная воспалительная инфильтрация разной степени выраженности (см. рис. 2). Среди инфильтрата в эпителии присутствовали лишь нейтрофильные лейкоциты и лимфоциты, в то время как в соединительной ткани также обнаруживались плазматические клетки и макрофаги. Большинство клеток воспалительного инфильтрата в подэпителиальных отделах располагалось вокруг кровеносных сосудов (периваскулярно). При этом элементы коллагенового матрикса не были обнаружены ни в одном из образцов во 2-й группе, что указывало на ее полную резорбцию на момент биопсии.

В сосочковом и сетчатом слоях определялись многочисленные коллагеновые волокна, однако наиболее организованное и плотное распределение волокон отмечалось в сетчатом слое. При поляризационной микроскопии в сосочковом и сетчатом слоях отмечалось яркое свечение, связанное с анизотропией (феноменом двойного лучепреломления) входящих в их состав волокон, что позволяло более достоверно подтвердить коллагеновую природу этих волокон и произвести измерения их площади в ходе морфометрии (рис. 3).

Рис. 3. Распределение, тинкториальные и оптические свойства коллагеновых волокон в биоптатах слизистой в обеих группах.

При поляризационной микроскопии — яркое желто-оранжевое или оранжево-красное свечение, окраска пикросириусом красным, ×100.

Тучные клетки в обеих группах располагались периваскулярно в сосочковом и сетчатом слоях, отличались умеренным полиморфизмом и неравномерным характером распределения в биоптатах пациентов 1-й и 2-й групп (рис. 4).

Рис. 4. Распределение тучных клеток в биоптатах слизистой в обеих группах.

Тучные клетки (желтые стрелки) отличаются темно-фиолетовой цитоплазмой, цвет которой обусловлен многочисленными гранулами. Микроскопия в светлом поле, окраска толуидиновым синим для тучных клеток, ×400.

Результаты морфометрического исследования

Статистическая обработка результатов морфометрии показала отсутствие достоверных различий между первой и второй группой по большинству морфометрических показателей, за исключением средней и максимальной толщины эпителиального пласта, относительной клеточности базального слоя и его митотической активности, а также — максимальной длине гребней. Так, во 2-й группе показатели средней и максимальной толщины эпителиального пласта были меньше, чем в 1-й группе. Однако различия в истинной средней толщине (относительной площади) пластов в двух группах отсутствовали. Кроме того, в 1-й группе отмечались достоверно более длинные эпителиальные гребни. В то же время, данный показатель существенно не повлиял на протяженность базальной мембраны, хоть ее относительная длина была несколько больше в 1-й группе, чем во 2-й (рис. 5—8).

Рис. 5. Показатели толщины (в µm) пластов многослойного плоского эпителия в биоптатах.

Данные представлены как график «скрипка», точками указаны данные, пунктирные линии — 25, 50, 75 квантили; ns — not significant.

Рис. 6. Показатели относительной клеточности пластов многослойного плоского эпителия в биоптатах (клеток/µm²).

Данные представлены как график «скрипка», точками указаны данные, пунктирные линии — 25, 50, 75 квантили; ns — not significant (статистически недостоверные различия).

Рис. 7. Показатели митотической активности пластов многослойного плоского эпителия в биоптатах.

Данные представлены как график «скрипка», точками указаны данные, пунктирные линии — 25, 50, 75 квантили; ns — not significant (статистически недостоверные различия).

Рис. 8. Показатели морфологических особенностей гребней многослойного плоского эпителия в биоптатах.

Данные представлены как график «скрипка», точками указаны данные, пунктирные линии — 25, 50, 75 квантили; ns — not significant (статистически недостоверные различия).

Обсуждение результатов

Известно, что морфофункциональные особенности мягких тканей в области имплантатов способствуют снижению резистентности к механическим нагрузкам и бактериальной инвазии, повышая риск развития таких осложнений, как мукозит, периимплантит, рецессия мягких тканей [2]. Именно поэтому особое значение в профилактике развития воспалительных и эстетических осложнений вокруг дентального имплантата имеют такие параметры, как ширина зоны кератинизированной прикрепленной слизистой и толщина мягких тканей [2, 3].

Многие зарубежные и отечественные авторы проводили исследования, посвященные изучению такого параметра, как ширина кератинизированной прикрепленной слизистой, и методов ее увеличения, в том числе с использованием коллагеновых матриксов [7, 10]. Однако данных по применению коллагеновых матриксов для увеличения такого параметра, как толщина мягких тканей в области имплантатов, на сегодняшний день недостаточно. Есть строгое понимание, что современные аналоги мягкотканных аутотрансплантатов должны соответствовать ряду критериев: быстрая интеграция в окружающие ткани с минимальной воспалительной реакцией, деградация и замещение аутогенной мягкой соединительной тканью и ее стабильность. В связи с этим необходимо отметить дефицит фундаментальных исследований, связанных с изучением гистоморфометрического строения тканей, полученных при использовании коллагеновых матриксов, в сравнении с аутогенными материалами для увеличения толщины мягких тканей в области имплантатов.

В проведенном нами гистологическом исследовании тканей, полученных при использовании коллагенового матрикса, было выявлено, что в обеих группах вновь образованная слизистая оболочка биоптатов была выстлана многослойным плоским эпителием разной толщины, который был отграничен от сосочкового слоя базальной мембраной. Под сосочковым слоем определялся сетчатый слой с более компактным расположением коллагеновых волокон. Во 2-й группе показатели средней и максимальной толщины эпителиального пласта были меньше, чем в группе, где использовался свободный соединительнотканный трансплантат. Полученные результаты коррелируют с данными других авторов, которые описывают получение многослойного эпителия с эпидермальными выступами в толщу соединительной ткани, богатой нитями коллагеновых волокон, капиллярами с присутствием макрофагов и фибробластов [1—4, 8].

В нашем исследовании различия в истинной средней толщине (относительной площади) пластов в двух группах отсутствовали. В 1-й группе отмечались достоверно более длинные эпителиальные гребни. В то же время, данный показатель существенно не повлиял на протяженность базальной мембраны, хоть ее относительная длина была несколько больше, чем во 2-й группе.

Полученные результаты морфометрии, вероятнее всего, взаимосвязаны, поскольку в участках с более длинными гребнями в группе контроля отмечалась наибольшая толщина эпителия. Показатели пролиферативного потенциала эпителия, представленные относительной клеточностью базального слоя и долей митозов в базальном слое во 2-й группе, были также достоверно ниже, чем в 1-й группе.

Похожие исследования проводились и зарубежными учеными. Так, гистоморфометрическое исследование, проведенное H. Monteiro, в котором сравнивались зоны аугментации при помощи соединительнотканного трансплантата и коллагеновой матрицы (Mucograft Seal) через 3 мес, показало полную резорбцию матрикса и замену его здоровой соединительной тканью без признаков воспалительной инфильтрации. Подсчет количества и распределения фибробластов показал сходство во всех образцах обеих групп [11]. Thoma и соавт. также проводили гистоморфометрическое исследование тканей у пациентов после проведенной аугментации с помощью соединительнотканного трансплантата и коллагеновой матрицы через 3 мес после операции. В группе, где использовался трансплантат, наблюдалась относительно рыхлая сеть коллагеновых волокон с небольшим воспалительным инфильтратом. В группе, где использовалась мембрана, отмечалась плотная коллагеновая сеть. Как в первой, так и во второй группе наблюдалось большое число новообразованных кровеносных сосудов. Выраженных различий в строении новообразованной ткани как в 1-й, так и во 2-й группе выявлено не было [6].

Стоит отметить, что исследования, направленные на изучение клинической эффективности применения коллагеновой матрицы в пародонтологии, проводились ранее отечественными авторами. Так, например, А. Ведяева и соавт. пришли к выводу, что ксеногенный коллагеновый матрикс является достойной альтернативой соединительнотканному трансплантату и может использоваться при устранении рецессий десны у пациентов с дефицитом прикрепленной кератинизированной десны [12]. Коллагеновые мембраны успешно зарекомендовали себя на стоматологическом рынке, однако исследования, направленные на изучение эффективности их использования, в различных клинических ситуациях еще проводятся.

Заключение

Гистоморфометрическое исследование тканей, полученных в результате использования коллагенового матрикса, демонстрирует возможность применения коллагеновой матрицы для формирования мягких тканей в области дентальных имплантатов, практически идентичных по строению с биоптатами, полученными после применения аутогенных трансплантатов, с отсутствием достоверных различий по большинству характеристик.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.