Исследование содержания белков-маркеров апоптоза в слизистой оболочке полости рта пациентов с веррукозной формой лейкоплакии

Веррукозная форма лейкоплакии относится к факультативным предопухолевым заболеваниям и характеризуется различной степенью патологического ороговения покровного эпителия. Установлено, что переход лейкоплакии в злокачественную форму связан с апоптозом клеток в области поражения, поэтому злокачественный потенциал веррукозной формы лейкоплакии составляет от 30 до 70% от всех стоматологических предраковых заболеваний [1, 3].

Развитие апоптоза реализуется двумя путями: внешний путь запускается через связывание с рецепторами клеток фактора некроза опухоли, фактора роста нервов и др. с последующей активацией протеолитического фермента каспазы-8. Внутренний путь регулируется митохондриями и включается токсическими повреждениями генома, гипоксией, свободными радикалами, нарушениями регуляции факторами роста, что ведет к высвобождению факторов, индуцирующих апоптоз. В этом случае активируется каспаза-9, которая в свою очередь активирует эффекторные каспазы-3,6,7, участвующие в расщеплении макромолекул, и процесс, запущенный программой смерти, становится необратимым [8-10]. Повреждение клеток сопровождается изменениями со стороны плазматических мембран, меняется структура белков и мембранных фосфолипидов, наблюдается транслокация мембранного фосфолипида фосфатидилсерина с внутренней стороны плазматической мембраны на ее внешнюю сторону. Сродством к фосфатидилсерину обладает белок аннексин V, который, связываясь с фосфолипидами на поверхности клеточной мембраны, обеспечивает защиту клеток от апоптоза [2, 4-7].

Цель настоящего исследования - изучение содержания каспазы-9 и аннексина V в участках поражения веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта (СОПР).

В центре стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ обследованы 108 пациентов (52% женщин и 48% мужчин, средний возраст 58,1±5,68 года) с веррукозной формой лейкоплакии. На доклиническом этапе обследование включало сбор анамнеза, осмотр СОПР, участка поражения.

До оперативного вмешательства у 20 пациентов с их письменного согласия производили биопсию СОПР в участке поражения. Полученный биоптат отмывали от крови в 0,9% растворе NaCl, растирали в фарфоровой ступке с кварцевым песком на холоде в соотношении 1:1. Растворимые белки экстрагировали 0,5 М раствором NaCl в соотношении 1:10. Полученные гомогенаты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Гомогенаты слизистой оболочки полости рта до начала исследования хранили при –28 °С. После однократного размораживания в образцах слизистой оболочки полости рта методом иммуноферментного анализа определяли содержание аннексина V и каспазы-9 в нанограммах на 1 мг ткани (Bender MedSystems). Для сравнительного анализа исследовали биоптаты слизистой оболочки полости рта у 5 здоровых пациентов, не имеющих в анамнезе соматических патологий и воспалительных изменений в полости рта. Биоптаты слизистой оболочки у здоровых пациентов получали в ходе плановых хирургических операций по удалению разрушенных корней зубов.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica 6.0. Данные представлены как среднее и стандартное отклонение для нормального распределения. Значимость различий для количественных переменных между несвязанными группами оценивалась по критерию Манна-Уитни, значимость различий в связанных группах оценивалась по критерию Вилкоксона. Для анализа взаимосвязи признаков применялся корреляционный анализ по Спирмену. Статистически значимыми считались различия при p<0,05.

По нашим данным, длительность заболевания у обследованных пациентов в среднем составила 1,55±0,5 года. Наиболее часто больные связывали развитие данного заболевания с вредными привычками - 38 (35%) пациентов; на хроническую травму СОПР некачественными зубными протезами, реставрациями, привычкой держать во рту инородные предметы указывали 32 (30%) пациента. Веррукозная форма лейкоплакии развивалась на фоне заболеваний желудочно-кишечного тракта и сердечно-сосудистой системы у 14 (13%) пациентов. У 24 (22%) пациентов предрасполагающих факторов выявить не удалось. Площадь поражения слизистой оболочки полости рта у пациентов с веррукозной формой лейкоплакии варьировала от 0,25 до 6,0 см² и в среднем равнялась 2,28±0,40 см². По нашим данным, чаще всего лейкоплакия локализовалась в области слизистой оболочки дна полости рта - у 36 (33%) пациентов, несколько реже в области слизистой щек и языка - по 28 (26%) пациентов. Проведенный корреляционный анализ выявил тенденцию к положительной корреляционной связи между вредными привычками и развитием патологического процесса на слизистой оболочке полости рта (r=0,42; р=0,067).

Количество аннексина V в здоровой СОПР колебалось от 280 до 828 нг на 1 мг ткани, что в среднем составило 546±59,7 нг на 1 мг ткани. У пациентов с веррукозной формой лейкоплакии количество этого белка в биоптатах СОПР было ниже в 4 раза и в среднем равнялось 51,0±7,18 нг на 1 мг ткани (рис. 1, а).

Содержание каспазы-9 в биоптатах неизмененной слизистой оболочки полости рта выявлено не было, а в участках поражения веррукозной формой лейкоплакии определялось высокое количество этого протеолитического фермента - 120±32,8 нг на 1 мг ткани (рис. 1, б).

Таким образом, наши данные показывают, что при веррукозной форме лейкоплакии СОПР наблюдается увеличение количества каспазы-9 на фоне снижения содержания аннексина V, что отражает высокодостоверная положительная корреляционная связь (r=0,75; р=0,0001). При сопоставлении количества исследованных белков с длительностью заболевания и площадью поражения установлено отсутствие корреляционной зависимости от длительности заболевания. Однако при сопоставлении количества исследованных белков с площадью поражения СОПР выявлено, что при большей площади поражения определяется меньшее содержание аннексина V и увеличение количества каспазы-9 (рис. 2).

Таким образом, полученные результаты показывают, что при веррукозной форме лейкоплакии СОПР активируется внутренний путь включения развития апоптотических реакций. При этом страдает система защиты мембран, что выражается в резком уменьшении белка аннексина V и наличии в высоких количествах каспазы-9. Полученные результаты имеют большое значение для клинической практики, поскольку они показывают, что процессы апоптоза становятся необратимыми, невозможны процессы регенерации и существует необходимость в полном иссечении пораженных участков.