Заметно ускоренный ритм жизни и неблагоприятные условия среды стали основными спутниками жизни человека в последние десятилетия. Мы начали все больше соприкасаться с постоянно возникающими источниками научно-технических преобразований, и эти источники стали неотъемлемыми атрибутами нашей повседневной жизни. В первую очередь это касается информационных технологий. Известно, что экологические факторы в совокупности с постоянным информационным потоком индуцируют в организме состояние окислительного стресса, оказывающего неблагоприятное воздействие на функциональные системы организма и генетический материал [1]. Речь идет не только о системах жизнеобеспечения (кардиореспираторная, пищеварительная, эндокринная, нервная), но также касается вопросов репродуктивного здоровья [2]. Ни для кого не секрет, что в настоящее время мы окружены множеством полей всякого рода излучений, которые так или иначе воздействуют на все живые системы, включая человека. Излучения характеризуются широким диапазоном частот, именно высокочастотные излучения и излучения крайне высоких частот (КВЧ-излучения) на сегодняшний день являются превалирующими источниками электромагнитных волн. Эти излучения лежат в микроволновом диапазоне и связаны с работой телекоммуникационных систем, таких как телевидение, радио, мобильная связь и компьютеры [3]. Кроме того, многие приборы, используемые в медицинской практике, оказывают свое действие за счет генерации микроволновых излучений (МВИ). Эти излучения в зависимости от направленности потока могут затрагивать различные системы организма, в том числе репродуктивную. Необходимо также подчеркнуть, что в некоторых случаях воздействие микроволн может быть как кратковременным, так и длительным. А если учесть тот факт, что незрелые стволовые и малодифференцированные половые клетки весьма чувствительны ко всякого рода неблагоприятным воздействиям, в том числе МВИ, возникает необходимость исследования последствий такого рода воздействий на половые клетки в условиях различной их длительности (экспозиции) [4, 5]. Учитывая масштаб обозначенной проблемы, в данном исследовании мы ограничимся изучением влияния МВИ на систему репродукции мужского типа.
Цель исследования — выявить последствия воздействия высокочастотного МВИ на репродуктивные процессы системы размножения мужского типа в эксперименте.
Материал и методы
Дизайн исследования
Для достижения заявленной цели поставлена задача проведения экспериментального исследования на животных; сбор данных осуществлялся одномоментно по окончании экспериментальных воздействий. Проводимое исследование относится к разряду выборочного контролируемого исследования, в котором экспериментальные животные распределены между группами случайным образом (рандомизированное исследование). Выделены три группы животных: контроля и две экспериментальные. Экспериментальные группы подвергались воздействию МВИ в течение двух разных периодов времени.
Критерии соответствия
Для эксперимента брали половозрелых самцов белых крыс массой в пределах 230—270 г и возрастной категории не более 1 года. Животные с иными характеристиками не включались в исследование.
Условия проведения
Исследование проводилось на базе кафедры химии ФГБОУ ВО «Астраханский ГМУ» Минздрава России. Эксперимент осуществлялся в осенний период времени в условиях вивария и лаборатории при нем.
Продолжительность исследования
Исследование проводилось в течение сентября—октября 2018 г. Основная часть эксперимента (воздействие МВИ) приходилась на вторую половину сентября и первую половину октября. Перед началом эксперимента животные адаптировались в условиях вивария в течение 2 нед (первая половина сентября). Смещения запланированных временных интервалов (сроков) в ходе эксперимента не происходило.
Описание медицинского вмешательства
Самцов белых крыс массой 258±10 г подвергали воздействию МВИ КВЧ-диапазона (42 ГГц, λ=7,1 мм) с помощью генератора монохроматических волн Явь0—1-7,1 (АО «НПП»Исток» им. А.И. Шокина», Россия) в течение 14 и 30 дней по 30 мин ежедневно в рамках сформированных для этого экспериментальных (опытных) групп. По завершении экспериментальных воздействий животных декапитировали под эфирным наркозом с соблюдением норм Женевской конвенции (1985). Далее производили забор крови, готовили гомогенаты тканей медиобазального гипоталамуса и семенников для исследования последствий экспериментального воздействия.
Основной исход исследования
В качестве основных критериев оценки репродуктивной функции мужского типа в эксперименте мы рассматривали морфологические показатели функционального состояния семенников: диаметры семенных канальцев, высоту сперматогенного эпителия, количество интерстициальных эндокриноцитов (клеток Лейдига), приходящихся на один каналец, площадь ядер клеток Лейдига; давали общую оценку морфофункционального состояния тестикулярной ткани. Кроме того, оценивали состояние тестикулярного сперматогенеза.
Дополнительные исходы исследования
В дополнение к основным показателям, характеризующим последствия воздействия МВИ на мужскую репродуктивную систему, определяли уровни половых гормонов в плазме крови — лютеинизирующего гормона (ЛГ) и тестостерона. Кроме того, определяли уровень свободнорадикального окисления (СРО) в гомогенатах тканей медиобазального гипоталамуса и семенников. Выраженность процессов СРО в крови оценивали по уровню перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ).
Анализ в группах
Для проведения исследования сформированы три группы животных: контроля и две опытные (О-1 и О-2). Отбирали половозрелых самцов белых крыс не моложе 6 мес и не старше 1 года.
Методы регистрации исходов
В одной части крови измеряли ПГЭ по методу А.А. Покровского и А.А. Абрарова на спектрофотоколориметре КФК-3 (Россия). Другую часть крови центрифугировали для получения плазмы, которую далее исследовали на содержание в ней ЛГ и тестостерона иммуноферментным методом с помощью наборов реактивов, укомплектованных ООО «Хема» (Россия). Для оценки уровня липопероксидации в тканях медиобазального гипоталамуса и семенников измеряли базовый уровень малонового диальдегида (МДА), а также кинетические показатели липопероксидации (спонтанное и аскорбатзависимое перекисное окисление липидов: спПОЛ, асПОЛ) спектрофотометрическим методом, предложенным И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили [5]. Для получения морфологических данных изготавливали срезы семенников толщиной 7 мкм, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином [6]. Тестикулярный сперматогенез оценивали с использованием метода, предложенного В.П. Маминой и Д.И. Семеновым [7]. Подсчет отдельных клеток сперматогенеза осуществляли в камере Горяева при увеличении 600.
Этическая экспертиза
Представленное в настоящей статье исследование рассмотрено на заседании локального этического комитета (ЛЭК) от 2 марта 2020 г. (протокол №2). В заключении ЛЭК отмечается, что: а) в материалах исследования не содержатся сведения, нарушающие права на результаты интеллектуальной деятельности юридических или физических лиц; б) исследование проводилось с соблюдением этических норм о гуманном отношении к животным при выполнении опытов (с использованием эфирного наркоза) в соответствии с требованиями Женевской конвенции (1985 г.). Протокол подписан 03.03.20.
Статистический анализ
Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.
Методы статистического анализа данных: а) при проведении статистического анализа результатов использовали программу MedCalc («MedCalc Software», Бельгия); б) формат представления количественных данных M±m; в) для выполнения статистической обработки полученных результатов использовали критерий Стьюдента (t), при этом статистически значимыми считали различия при значениях p<0,05. Оценку взаимосвязи между уровнями гормонов ЛГ и тестостерона осуществляли путем подсчета коэффициента линейной корреляции (r) Пирсона [8].
Результаты
Объекты исследования
Объектами исследования явились половозрелые самцы белых крыс линии Wistar массой 258±10 г. Всего для экспериментального исследования использовано 45 животных по 15 в каждой из трех групп.
Основные результаты исследования
Под действием МВИ у животных группы О-1 количество сперматогенных клеток возросло почти на 22% по сравнению со значениями у животных группы контроля (p<0,001). В то же время в группе О-2 общее количество сперматогенных клеток оказалось значительно сниженным. Вместе с тем следует отметить, что в течение первых 2 нед от начала воздействия у животных группы О-1 относительное количество сперматогоний и сперматоцитов возросло. Доля более зрелых форм (сперматиды, сперматозоиды), напротив, снизилась (табл. 1).\Таблица 1. Состояние тестикулярного сперматогенеза у крыс при воздействии микроволнового излучения
| Показатели тестикулярного сперматогенеза | Группа контроля (n=15) | Группа О-1 (n=15) | Группа О-٢ (n=15) |
| Общее количество сперматогенных клеток, млн | 5234±271,0 (100%) | ***6373±114 (122%) | **4352±153,0 (83%) |
| Сперматогонии, % | 22,4±1,51 | 29,2±1,72 | 26,0±1,22 |
| Сперматоциты, % | 20,6±1,66 | 23,7±1,22 | 27,3±1,43 |
| Сперматиды, % | 21,5±1,75 | 18,6±1,20 | 20,8±1,11 |
| Сперматозоиды, % | 35,1±2,65 | 28,5±1,62 | 25,9±1,74 |
Примечание. ** — p<0,01; *** — p<0,001 — по сравнению с показателями группы контроля.
У животных группы О-2 отмечалось снижение относительного количества сперматогоний в общей популяции сперматогенных клеток по сравнению с животными группы О-1. В суспензии преобладали сперматоциты, причем как по сравнению с группой О-1, так и с контролем. Таким образом, наиболее уязвимым звеном сперматогенеза после 2-й недели воздействия МВИ оказались сперматогонии.
У животных группы О-2 диаметры семенных канальцев практически не отличались от таковых у животных контрольной группы. МВИ вызвало у крыс группы О-2 прирост общего количества интерстициальных эндокриноцитов за счет в основном средних клеток Лейдига, площадь которых вместе с тем имела тенденцию к снижению (табл. 2).
Таблица 2. Морфометрические показатели семенников крыс при воздействии микроволнового излучения
| Условия опыта | Диаметр семенных канальцев, мкм | Высота сперматогенного эпителия, мкм | Количество клеток Лейдига на один каналец | Площадь ядер клеток Лейдига, мкм2 | |
| продольный | поперечный | ||||
| Группа контроля | 250,1±3,62 | 125,2±3,82 | 71,2±1,24 | 7,3±0,53 | 16,2±2,31 |
| Группа О-1 | 272,5±4,05** | 145,3±4,45** | 88,6±2,00*** | 8,7±0,62* | 16,6±0,88 |
| Группа О-2 | 232,2±3,95** | 140,1±6,02 | 53,2±2,12*** | 10,4±0,55*** | 15,3±1,03 |
Примечание. * — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p<0,001 — по сравнению с показателями группы контроля.
У животных группы О-1 семенные канальцы были достаточно наполненными разными типами сперматогенных клеток. Высота сперматогенного эпителия достаточно выражена и превышала показатели у крыс группы контроля. У животных группы О-2 клетки сперматогенного эпителия располагались хаотично, причем высота его была неравномерной, а в целом сниженной почти на четверть по сравнению с показателями у крыс группы контроля (см. табл. 2). Базальная мембрана имела в ряде случаев разрывы и отслоения (рис. 1).
Рис. 1. Структура извитых канальцев семенников у крыс группы О-2.
Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.
Дополнительные результаты исследования
Под действием МВИ у животных группы О-1 уровень ПГЭ незначительно возрастал и статистически значимо не отличался от показателей у крыс группы контроля. После 2-й недели воздействия МВИ (группа О-2) в крови фиксировалось значительное усиление процессов СРО, о чем свидетельствует повышение уровня ПГЭ более чем на 20% по сравнению с животными группы контроля (p<0,05). Данное обстоятельство указывает на развитие состояния окислительного стресса в условиях длительного воздействия излучения.
В ткани семенников животных группы О-1 отмечалось незначительное повышение исходного уровня МДА по сравнению с крысами группы контроля (p<0,05), кинетические показатели не отличались от показателей животных группы контроля. Вместе с тем у крыс группы О-2 исходный уровень МДА возрастал на 38,5% (p<0,001), а уровень асПОЛ статистически значимо возрастал на 14% по сравнению с показателями у животных группы контроля (p<0,001). В гомогенатах ткани медиобазального гипоталамуса животных групп О-1 и О-2 базовые уровни МДА возросли на 34 и 46% соответственно по сравнению со значениями у животных группы контроля (p<0,001). Вместе с тем следует отметить, что показатели липопероксидации в гипоталамической ткани превосходили таковые в ткани семенников (рис. 2), что, очевидно, связано с более высоким, чем в семенниках, содержанием основного субстрата липопероксидации — липидов [9].
Рис. 2. Изменение базового уровня малонового диальдегида в тестикулярной и гипоталамической тканях при воздействии микроволнового излучения.
Кинетические показатели ПОЛ в гипоталамической ткани (спПОЛ и асПОЛ) статистически значимо возрастали у крыс обеих групп, особенно группы О-1 (табл. 3). У животных группы О-2 кинетические показатели ПОЛ возрастали в меньшей степени, чем у крыс группы О-1. Указанный факт свидетельствует об адаптационных явлениях в гипоталамической ткани в условиях длительного воздействия МВИ как неблагоприятного фактора умеренной силы.
Таблица 3. Изменение показателей липопероксидации в тканях семенников и гипоталамуса при воздействии микроволнового излучения
| Условия опыта | n | МДАисх, нмоль/٠,٠٥ г | Кинетические показатели, нмоль МДА/ч | |
| спПОЛ | асПОЛ | |||
| Семенники | ||||
| Группа контроля | 15 | 4,89±0,151 | 45,97±0,840 | 48,74±0,702 |
| Группа О-1 | 15 | 5,12±0,172 | 47,24±1,783 | 48,80±0,812 |
| Группа О-2 | 15 | 6,77±0,272*** | 48,32±2,003 | 55,21±0,894*** |
| Гипоталамус | ||||
| Группа контроля | 15 | 5,45±0,280 | 56,68±1,145 | 62,95±1,451 |
| Группа О-1 | 15 | 8,15±0,402*** | 70,10±1,220*** | 81,12±1,920*** |
| Группа О-2 | 15 | 7,94±0,506*** | 62,38±1,401* | 69,52±2,007** |
Примечание. * — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p<0,001 — по сравнению с показателями группы контроля. МДА — малоновый диальдегид; спПОЛ — спонтанное перекисное окисление липидов; асПОЛ — аскорбатзависимое перекисное окисление липидов.
У животных группы О-1 наблюдалось снижение уровня ЛГ в плазме крови (p<0,001); уровень тестостерона при этом возрос на 18% по сравнению со значениями у крыс группы контроля (p<0,05). Следует отметить, что изменение уровней тестостерона и ЛГ в плазме крови подчинялось обратной коррелятивной зависимости. У животных группы О-2 уровни тестостерона и ЛГ статистически значимо не отличались от значений у крыс группы контроля (табл. 4).
Таблица 4. Изменение уровней тестостерона и лютеинизирующего гормона в плазме крови животных при воздействии микроволнового излучения
| Группы животных | n | Тестостерон, нг/мл | Лютеинизирующий гормон, мМЕ/мл | r | pr |
| Группа контроля | 15 | 2,829±0,0731 | 0,425±0,0538 | +0,935 | <0,05 |
| Группа О-1 | 15 | 3,339±0,1484* | 0,355±0,0341* | 0—0,748 | <0,05 |
| Группа О-2 | 15 | 2,614±0,1160 | 0,420±0,0068 | +0,634 | <0,05 |
Примечание. * — p<0,05 — по сравнению с показателями группы контроля.
Снижение секреции ЛГ у крыс группы О-1, очевидно, связано с развитием дезадаптационных процессов на уровне медиобазального гипоталамуса, в котором сосредоточены центры регуляции репродуктивных процессов. Кроме того, повышение секреции тестостерона интерстициальными эндокриноцитами угнетающе действует на секрецию ЛГ базофильными клетками аденогипофиза по механизму отрицательной обратной связи. Повышение же секреции тестостерона можно объяснить «пролиферативным» эффектом кратковременного воздействия МВИ на интерстициальные эндокриноциты семенников, в особенности на функционально активные средние клетки Лейдига, площадь ядер которых имела тенденцию к увеличению.
Нежелательные явления
В результате продолжительного действия МВИ КВЧ-диапазона наблюдается угнетение сперматогенеза за счет исчерпания ресурсов пролиферации стволовых половых клеток — сперматогоний А0.
Обсуждение
Резюме основного результата исследования
На начальных этапах воздействия МВИ (группа О-1) наблюдается пролиферация стволовых клеток сперматогенеза (сперматогоний типа А0). Возрастают количество средних клеток Лейдига и площадь их ядер. Длительное же воздействие высокочастотного МВИ (>2 нед) истощает ресурсы пролиферации сперматогенных клеток, преобладающей формой клеток являются сперматоциты. Прирост клеток Лейдига происходит на фоне некоторого снижения площади их ядер.
Обсуждение основного результата исследования
Кратковременное воздействие способно активировать ресурсы пролиферации сперматогенного эпителия за счет генерации целого каскада исходных клеток сперматогенеза — сперматогоний. Однако длительное воздействие МВИ постепенно подавляет сперматогенез. Одной из причин является усиление акустоэлектрических колебаний (колебаний Фрелиха), вызывающих изменение устойчивости мембран сперматозоидов. Однако следует подчеркнуть, что снижение устойчивости мембран сперматозоидов происходит также за счет усиления процессов СРО в тестикулярной ткани, поскольку половые клетки, особенно незрелые, очень чувствительны к действию свободных радикалов [10, 11]. Кроме того, облучение снижает ресурсы антиоксидантной системы, что в итоге индуцирует развитие свободнорадикальных процессов [5]. Развитие цепного механизма образования радикалов за счет окисления ненасыщенных фосфолипидов RH в тканях можно представить в виде следующей схемы:
Возрастание количества средних клеток Лейдига и площади их ядер у животных группы О-1 говорит в пользу повышения тестостеронпродуцирующей активности семенников. Указанное обстоятельство подтверждается данными иммуноферментного анализа (ИФА): уровень тестостерона статистически значимо повышался на первых этапах облучения. Таким образом, можно заключить, что повышение уровня тестостерона в плазме крови связано с пролиферацией средних клеток Лейдига. Активизация стероидогенеза положительно сказывается и на отдельных этапах сперматогенеза [12]. Уровень ЛГ у крыс группы О-1, напротив, снижался в условиях облучения, что, очевидно, обусловлено угнетением функционального состояния гипоталамуса за счет усиления процессов липопероксидации в его ткани, поскольку известно, что угнетение функционального состояния медиобазального гипоталамуса сопровождается повышением активности серотонинергических нейронов, угнетающе действующих на секрецию люлиберина в область срединного возвышения [13, 14]. При длительном воздействии МВИ прирост клеток Лейдига происходит на фоне снижения площади их ядер, что позволяет говорить о практически неизменной по сравнению с контролем тестостеронпродуцирующей активности гонад.
Таким образом, можно заключить, что: 1) кратковременное воздействие МВИ вызывает активацию спермато- и стероидогенеза за счет стимуляции ресурсов пролиферации сперматогенного эпителия; 2) длительное воздействие МВИ, напротив, постепенно снижает ресурсы пролиферации сперматогенных клеток; в основе механизма угнетения сперматогенеза при длительном воздействии высокочастотного МВИ лежит усиление акустоэлектрических колебаний в мембранах сперматозоидов, активирующих прооксидантные механизмы, которые вызывают разрушение мембран незрелых половых клеток, неспособных к дальнейшей эффективной дифференцировке в процессе сперматогенеза.
Ограничения исследования
Ограничительным фактором является сезонный, поскольку он определяет гормональные изменения в организме животных и человека, особенно весной и зимой. В летний период ограничения связаны с температурным режимом (особенно в жарких регионах). В связи с этим оптимальным временем года для проведения исследований подобного рода является ранняя осень.
Выводы
К настоящему времени известно, что длительное излучение истощает ресурсы антиоксидантной системы в семенниках. Вместе с тем считается, что нарушение сперматогенеза под воздействием электромагнитных волн связано с нарушением устойчивости мембран сперматозоидов в результате усиления акустоэлектрических колебаний Фрелиха. В то же время в подобных исследованиях не учитывалась возможность этих колебаний индуцировать свободнорадикальные окислительные процессы, лежащие в основе развития окислительного стресса. В данном исследовании показано, что кратковременное МВИ миллиметрового диапазона вызывает улучшение как экскреторной, так и инкреторной функций мужских гонад. Однако длительное воздействие МВИ миллиметрового диапазона истощает ресурсы пролиферации половых клеток за счет его разрушительного действия на сперматогонии. В основе деструктивного действия излучения лежит истощение систем антиоксидантной защиты половых клеток на фоне индуцирования возникающими акустоэлектрическими колебаниями процессов свободнорадикального окисления как в тестикулярной ткани. Учитывая, что сперматогенные клетки, особенно стволовые половые клетки (сперматогонии), очень чувствительны к действию свободных радикалов, можно заключить, что нарушение пролиферации сперматогенных клеток связано с их гибелью в условиях усиления радикалообразования. Кроме того, угнетению сперматогенеза способствует постепенное ослабление стероидогенеза в результате начала инволюции клеток Лейдига. Регуляторные воздействия со стороны гипоталамо-гипофизарного комплекса на эндокринный аппарат семенников в условиях длительного воздействия МВИ не выявлены. Результаты проведенного исследования могут быть экстраполированы на репродуктивную систему мужчин после дополнительных клинических испытаний.
Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам кафедры биологической химии и кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России за техническую поддержку при проведении настоящего исследования.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Николаев А.А., Логинов П.В.
Сбор и обработка материала — Логинов П.В., Кузнецова М.Г.
Статистический анализ данных — Логинов П.В., Кузнецова М.Г.
Написание текста — Памешова А.К., Мавлютова Е.Б.
Редактирование — Николаев А.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.