Анализ липидного состава плазмы крови методом масс-спектрометрии у пациенток с миомой матки

Миома матки (ММ) является одной из наиболее распространенных доброкачественных опухолей женской половой сферы, которая выявляется у 20—40% женщин репродуктивного возраста [1—3] и занимает второе место в структуре гинекологической заболеваемости [4]. ММ — это доброкачественная, моноклональная, хорошо отграниченная, капсулированная опухоль, происходящая из гладкомышечных клеток шейки или тела матки [5].

Несмотря на многочисленные исследования, посвященные различным аспектам ММ, до сих пор не до конца изучены этиология и патогенез этого заболевания, отсутствуют методы его ранней диагностики, а также способы прогноза рецидивирования. В связи с этим представляет большой интерес разработка современных принципов ранней диагностики ММ, а в последующем и рецидива ММ с использованием высокоинформативного метода масс-спектрометрии (МС).

МС — метод анализа вещества путем определения отношения массы к заряду и относительного количества ионов, получаемых при ионизации компонентов исследуемого образца [6]. В клиническую практику введены MС метаболомные тесты для диагностики и прогнозирования хронической болезни почек [7], преэклампсии [8]; изучаются метаболомные биомаркеры эндометриоза [9].

В настоящем исследовании проведен анализ содержания липидов в плазме крови больных с ММ и пациенток группы сравнения до проведения оперативного вмешательства. Преимуществами использования плазмы крови для диагностики ММ являются малоинвазивность и простота метода забора крови.

Цель исследования — выявить биомаркеры для ранней неинвазивной диагностики ММ на основании изучения липидного состава плазмы крови методом МС.

В исследование включены 35 пациенток (основная группа) с диагнозом «миома матки». Группу сравнения составили 15 пациенток с бесплодием, внутриматочной перегородкой. Всем 50 пациенткам выполнены реконструктивные операции с применением лапароскопического доступа в отделении оперативной гинекологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» (директор — акад. РАН, д.м.н., проф. Г. Т. Сухих).

Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова».

ММ обнаружена при влагалищном исследовании, диагноз подтвержден данными ультразвукового исследования, лапароскопии и (окончательно) гистологического исследования.

Основные жалобы пациенток с ММ, обратившихся для оперативного лечения, следующие: невынашивание беременности, бесплодие, болевой синдром при половом акте, нарушения менструального цикла (болезненные, обильные, нерегулярные менструации, межменструальные выделения), нарушение функции смежных органов (запоры, учащенное мочеиспускание).

При влагалищном исследовании размеры матки у пациенток обеих групп достигали 12—13 нед беременности. Средний возраст пациенток с миомой матки составил 37,8±5,5 года. Всем женщинам проведено хирургическое лечение в объеме лапароскопии, миомэктомии. Показаниями к оперативному лечению были обильные менструации, приводящие к анемии, выраженный болевой синдром, отсутствие эффекта от ранее проведенной консервативной терапии, отсутствие наступления беременности у женщин репродуктивного возраста. Пациенткам, составляющим группу сравнения, проводилось оперативное лечение с использованием лапароскопического и гистероскопического доступов в связи с наличием бесплодия или внутриматочной перегородки. Накануне операции у пациенток проводился забор крови (натощак). Кровь забирали в вакуумную стерильную пробирку с ЭДТА — натрий (0,5 мл 1,5% раствора на 10 мл крови) и центрифугировали в течение 10 мин при 2500 оборотах для получения плазмы. Затем плазму отбирали и переливали в стерильную пробирку типа Эппендорф 1 мл. Пробирки в жидком азоте транспортировали в биобанк, где хранили в морозильной камере при температуре –80 °С до анализа.

Экстракты липидов получали в соответствии с модифицированным методом Фолча [10]. В ходе данного эксперимента к 40 мл образца плазмы добавляли 480 мл смеси хлороформ—метанол (2:1). Смесь подвергалась действию ультразвука на протяжении 10 мин, после чего к ней добавляли 150 мл воды и пропускали через Vortex («IKA», Германия) в течение 10 с. Смесь центрифугировали в течение 5 мин при 15 000 об/мин при температуре окружающей среды. Отбирали органический слой, содержащий липиды, подвергали вакуумной сушке, затем повторно растворяли в смеси 100 мл изопропанола и 100 мл ацетонитрила для последующего масс-спектрометрического анализа.

Образцы анализировали на жидкостном хроматографе Dionex UltiМate 3000 («ThermoScientific», Германия), сопряженном с масс-спектрометром Maxis Impact qTOF («Bruker Daltonics», Германия). Экстракты липидов разделяли на колонке Zorbax SB-C18 (0,5×150 мм, сорбент 5 мкм, «Agilent Technologies», США), объем инжектируемого образца 3 мкл, скорость потока 40 мкл/мин, температура колонки 50 °C, градиент подвижной фазы: 0—0,5 мин, 70% А+30% В, 20,5—30,5 мин, 1% А+99% В, 31—33 мин, 70% А+30% В, где, А — 10 ммоль/л раствор формиата аммония и 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитрил/H₂O (60/40), В — 10 ммоль/л раствор формиата аммония и 0,1% раствор муравьиной кислоты визопропанол/ацетонитрил/H₂O (90/8/2). Масс-спектры получали в режиме положительных ионов в диапазоне m/z 400—1000 со следующими настройками: напряжение на капилляре 4,1 кВ, давление распыляющего газа 0,7 бар, скорость потока осушающего газа6 л/мин, температура осушающего газа 200 °C. Полученные данные обрабатывались многофакторным методом (O)PLS-DA, позволяющим построить статистическую модель на некоторой обучающей выборке, для которой принадлежность каждого образца к той или иной группе известна. Затем каждый новый образец встраивался в уже существующую модель, и оценивалась принадлежность нового образца какой-либо из рассматриваемых групп. Данный подход позволил классифицировать образцы, выяснять, какие именно ионы ответственны за различия в группах. Липиды идентифицировали с использованием R-скрипта Lipid Match по точной массе с помощью базы данных Lipid Maps [11] и характерным тандемным масс-спектрам.

В последнее десятилетие для поиска маркеров различных заболеваний все чаще используются постгеномные методы анализа, среди которых метаболомные и протеомные технологии занимают главные позиции [12]. Данные технологии позволяют быстро и с высокой точностью определить молекулярный состав любого биологического образца.

В образцах плазмы крови идентифицировано 267 липидных соединений. При этом отмечается статистически значимая разница в уровне 43 липидов у больных с ММ и без (методом Манна—Уитни определена статистически значимая разница значений с p<0,05). Липиды-маркеры относятся к холестериновым эфирам (2 соединения), фосфотидилхолинам и лизофосфотидилхолинам (15), сфинголипидам (6), плазмалогенам (8), ди- и триацилглицеролам (11), фосфотидилэтаноламинам (1). На основе данных об уровне потенциальных липидов-маркеров в плазме крови построена OPLS-DA модель для классификации пациенток основной группы с ММ и пациенток группы сравнения (рис. 1).

Предложенная панель липидных биомаркеров может быть использована для неинвазивной диагностики ММ в отсутствие других опухолей и опухолевидных образований. Данное исследование продолжается с целью определения возможности использования выявленных липидов в качестве потенциальных биомаркеров рецидива заболевания.

Анализ липидного состава плазмы крови у пациенток с миомой матки позволил выявить ряд фосфолипидов и сфинголипидов, уровень которых в плазме крови существенно отличается от данного показателя у женщин группы сравнения. Сравнительное изучение масс-спектрометрических профилей плазмы крови позволит выявить новые молекулярные маркеры как для диагностики миомы матки, так и для прогнозирования рецидивов заболевания.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда 16−14−00029.

Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Тоноян Н.М. — аспирант отделения оперативной гинекологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: tonnar.13@bk.ru; https://orcid.org/0000-0002-1631-1829

Козаченко И.Ф. — к.м.н., ст.н.с. отделения оперативной гинекологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0003-1822-9164

Франкевич В.Е. — к.ф.-м.н., зав. отд. системной биологии в репродукции ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: v_frankevich@oparina4.ru; https://orcid.org/0000-0002-9780-4579

Чаговец В.В. — к.ф.-м.н., старший научный сотрудник лаборатории протеомики и метаболомики репродукции человека отдела системной биологии в репродукции ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: vvchagovets@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-5120-376X

Токарева А.О. — аспирант Московского физико-технического института, Москва, Россия; e-mail: alisa.tokareva@phystech.edu

Стародубцева Н.Л. — к.б.н., заведующая лабораторией протеомики репродукции человека ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: n_starodubtseva@oparina4.ru

Адамян Л.В. — д.м.н., проф., акад. РАН, руководитель отделения оперативной гинекологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-3253-4512

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Тоноян Н.М., Козаченко И.Ф., Франкевич В.Е., Чаговец В.В., Токарева А.О., Стародубцева Н.Л., Адамян Л.В. Анализ липидного состава плазмы крови у пациенток с миомой матки при помощи масс-спектрометрии. Проблемы репродукции. 2019;25(6):-37. https://doi.org/10.17116/repro201925061

Автор, ответственный за переписку: Тоноян Н.М. —
e-mail: tonnar.13@bk.ru