На сегодняшний день эндометриоз выходит на лидирующие позиции в структуре заболеваний, приводящих к бесплодию. Он поражает до 10% женщин репродуктивного возраста, проявляясь хроническими тазовыми болями, диспареунией и нарушением менструального цикла [1]. Современные представления о заболеваниях (в том числе и эндометриозе) основываются на изучении комплекса молекулярно-биологических процессов, составляющих основу пролиферации, апоптоза, инвазии и неоангиогенеза. Именно они определяют формирование эндометриоидных гетеротопий, клинические проявления и прогноз течения заболевания [2]. С точки зрения расширения нашего понимания патогенеза эндометриоза интересным представляется сравнение эутопического и эктопического эндометрия с нормальным эндометрием женщин без эндометриоза.

Рост и автономность эндометриоидных очагов обеспечиваются за счет неоангиогенеза, в развитии которого определенную роль играют металлопротеиназы (ММР) [3, 4]. MMP — ферменты, разрушающие белки соединительнотканного матрикса и тем самым потенцирующие инвазию эндометриоидных гетеротопий в подлежащие ткани [5]. Существует убеждение, что изучение значимости различных металлопротеиназ путем иммуногистохимического исследования при эндометриозе поможет обосновать использование их ингибиторов в качестве элементов патогенетической терапии генитального эндометриоза [6]. CD45 — уникальный и вездесущий мембранный гликопротеин, который экспрессируется почти во всех гемопоэтических клетках, за исключением зрелых эритроцитов. Важно подчеркнуть, что все мезенхимальные стволовые клетки и стромальные клеточные популяции эндометрия человека не имеют этого маркера, но он присущ лейкоцитам [7]. Учитывая вышеизложенное, с целью углубления понимания патогенеза эндометриоза было решено провести сравнительное иммуногистохимическое исследование ММР-1 и MMP-9, а также CD45 в эутопическом и эктопическом эндометрии пациенток с эндометриоидными кистами и нормальном эндометрии женщин без эндометриоза.

В исследование были включены 94 пациентки репродуктивного возраста. По наличию или отсутствию эндометриоидных кист яичников (ЭКЯ) они были разделены на две группы: 1-ю составили 70 пациенток с эндометриоидными кистами яичников; 2-я (группа сравнения) была представлена 24 пациентками с бесплодием неясного (неуточненного) генеза без эндометриоза.

Критериями включения в исследование для 1-й (основная) группы были репродуктивный возраст, ультразвуковые признаки эндометриоидных кист яичников, лапароскопически и морфологически подтвержденный диагноз эндометриоидной кисты яичника. Во 2-ю группу вошли женщины репродуктивного возраста с отсутствием эндометриоза при лапароскопическом вмешательстве. При наличии экстрагенитального эндометриоза, варикозного расширения вен малого таза, опухоли яичников или другой локализации, а также сопутствующей декомпенсированной экстрагенитальной патологии пациентки исключались из исследования.

Все исследования проводились с разрешения ЛЭК (протокол № 50/5 от 18.11.14) и при добровольном информированном согласии пациентки на участие в исследовании.

На первом этапе исследования проводился анализ клинико-анамнестических показателей и данных гинекологического осмотра. Пациенткам предлагалось заполнить опросник для анализа анамнестических данных до оперативного вмешательства.

Для 1-й группы на втором этапе исследования выполнялось эндоскопическое вмешательство с целью диагностики наружного генитального эндометриоза и подтверждения наличия эндометриоидных кист яичников, а также установления степени тяжести эндометриоза (соответственно пересмотренной классификации Американского общества фертильности — r-AFS). В ходе операции выполнялись удаление эндометриоидной кисты, сальпингоовариолизис, гистероскопия с забором материала для морфологического и морфометрического исследований. У пациенток 2-й группы показанием к диагностической лапароскопии служило бесплодие неуточненного генеза. Им проводились лапароскопия с хромогидротубацией и гистероскопией, забор цуга эндометрия для гистологического, морфологического и морфометрического исследований.

Дальнейшее гистологическое, иммуногистохимическое и морфометрическое исследования эндометриоидных кист яичников и соскобов эндометрия в 1-й группе, а также цугов из полости матки у пациенток 2-й группы были выполнены на III этапе нашей работы.

Ультразвуковое сканирование органов малого таза выполняли на 5—7-й день менструального цикла при помощи оборудования для ультразвуковой диагностики Toshiba (Eccocce) SSA340 с использованием конвексного электронного эндовагинального датчика с диапазоном частоты 3,5—6,5 MHz (Япония).

Оперативное вмешательство лапароскопическим доступом и гистероскопию выполняли с использованием оборудования фирмы «Karl Storz» (Германия) в условиях операционной гинекологического отделения под общей анестезией с искусственной вентиляцией легких. У пациенток 1-й группы цистэктомия проводилась по методике, способствующей максимальному сохранению нормальной ткани яичников [8, 9].

Полученный в ходе операции материал помещался в одноразовые герметичные контейнеры с соотношением фиксирующего раствора (10% забуференный формалин нейтральной реакции) к ткани как 10 и более к 1. Срезы толщиной не более 4 мкм получали путем проводки на ротационном микротоме Accu-Cut SRM Sakura. Окраска осуществлялась по обычной методике (гематоксилин Карацци и эозин водно-спиртовой, Vitrostain). Использовался покровной бальзам фирмы «Bio-Mount synthetic bases». Микроскопия осуществлялась с использованием микроскопа Nikon eclipse 50i. Используемые объективы: 10×/0,25, 20×/0,40, 40×/0,65, 100×а/1,25. Бинокуляры по 10х/22. Морфометрические исследования проводились с применением цифровой камеры Nikon digital sight DS-U3, пакета прикладных программ, персонального компьютера в комплекте с цифровой камерой (программа Windows 7).

Подготовка к ИГХ-исследованию проводилась по стандартной схеме гистологического исследования. Перед окрашиванием гистологические срезы депарафинизировали. В работе использовались следующие антитела:

— к ММР-9 (92 kDa Collagenase IV — Rabbit Polyclonal, «Спринг Биосайенс Корпорейшн»);

— к ММР-1 (Matrix Metalloproteinase 1 — Rabbit Polyclonal, «Спринг Биосайенс Корпорейшн»);

— мышиные моноклональные антитела к CD45 (Cell Marque Corporation, 6600 Sierra College Park Boulevard Rocklin, Ca 95677 United States).

Для всех количественных признаков в сравниваемых группах производилась оценка медианы с определением 25 и 75% процентилей (1—3-й квартиль). Для сравнения межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Краскела—Уоллиса для независимых выборок и медианный критерий. Проводился непараметрический корреляционный анализ с использованием критерия Спирмена. Для визуализации корреляционного анализа использовался пакет Graph Viz 2.38, что позволяло более полно оценивать результаты анализа. Обработка исходных признаков осуществлялась с использованием пакетов прикладных программ Statistica версии 12.5 и Excel 2010, SPSS 24.002.

По результатам проведенного исследования маркеров в эутопическом и эктопическом эндометрии у пациенток 1-й группы установлено, что имеются статистически значимые различия уровня ММР-1, ММР-9 и CD45 как в строме, так и железах (р<0,05). При этом экспрессия MMP1 повышена в эутопическом эндометрии как в железе, так и строме, а MMP-9 — только в железе. В строме уровень ММР-9 повышен в эктопическом эндометрии. Уровень CD45 в строме и железе эктопического эндометрия значительно превышает сравниваемые показатели в эутопическом эндометрии (табл. 1, рис.

При анализе исследуемых параметров в эутопическом эндометрии пациенток 1-й группы и в нормальном эндометрии у женщин группы сравнения статистически значимые отличия были отмечены в отношении MMP-9 и CD45. При этом уровень ММР-9 был повышен в железах эутопического эндометрия, а CD45 повышен как в строме, так и железе в эндометрии пациенток 2-й группы. Все данные представлены в табл. 2 и на

Повышение ММР-9 в эутопическом эндометрии по сравнению с нормальным может отчасти объяснить способность к инвазии эндометриоидных гетеротопий в подлежащие ткани [5].

Роли металлопротеаз в развитии эндометриоза на сегодняшний день посвящено большое количество исследований. Ранее было показано, что уровень ММР выше в эктопических очагах по сравнению с эутопическим эндометрием [4, 10]. Мы акцентировали свое исследование на значении ММР-1 и ММР-9; в результате было выявлено, во-первых, статистически значимое повышение концентрации ММР-9 в железах эутопического эндометрия по сравнению с нормальным. Однако при сравнении уровня обеих ММР в эутопическом и эктопическом эндометрии были выявлены статистически значимо высокие уровни маркеров именно в эутопическом эндометрии (как в железах, так и строме) в сравнении с эктопическим. Возможно, полученные данные объясняются длительностью существования эндометриоидных кист до выполнения оперативного вмешательства и связанным с этим снижением активности протеаз внутри них. Можно предположить, что активность ММР выше в начальной стадии «зарождения» эндометриоидной кисты на яичнике. К сожалению, сложно в каждом конкретном случае достоверно точно определить длительность персистенции кисты до ее диагностики во время консультации гинеколога. Тем не менее ранее А.Е. Колосов и В.А. Печеникова и соавт. [11, 12] в исследовании стадий развития эндометриоидных кист яичников выявили снижение железистой ткани с увеличением длительности существования кист. Важным итогом нашего исследования является повышение ММР именно в эутопичeском эндометрии по сравнению с нормальным, что, несомненно, подтверждает мнение о большей пролиферативной активности эутопичeского эндометрия.

Еще один исследованный нами маркер — это CD45 (общий антиген лейкоцитов). Мы получили незначительное, но статистически значимое его повышение в железах нормального эндометрия в сравнении с эутопическим. При этом выраженное и статистически достоверное повышение CD45 отмечено в эктопическом эндометрии по сравнению с эутопическим. Вероятным объяснением этому может служить тот факт, что CD45 присущ лейкоцитам [7], а полученные данные свидетельствуют о выраженном воспалительном процессе в эндометриоидных кистах.

У женщин с эндометриоидными кистами яичника эутопический эндометрий статистически значимо отличается по содержанию ММР-9 и CD45 как в железе, так и строме в сравнении с нормальным эндометрием. Повышение матриксных металлопротеиназ в эутопическом эндометрии свидетельствует о большей пролиферативной активности эутопического эндометрия по сравнению с нормальным. Повышенный уровень экспрессии CD45 в эктопическом эндометрии по сравнению с эутопическим свидетельствует о выраженном воспалительном процессе в ЭКЯ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Дубровина Светлана Олеговна — д.м.н., проф., главный научный сотрудник Научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России. Адрес: 344022, Россия, Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29. Телефон: 8 (918) 558-51-13. e-mail: s.dubrovina@gmail.com; https://orcid.org/0000-0003-2424-2672

Берлим Юлия Дмитриевна — к.м.н., заведующая консультативно-поликлиническим отделением ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России. Адрес: 344022, Россия, Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29. Телефон: 8 (918) 500-23-56. e-mail: juliaberlim@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-4582-0988

Арешян Кнарик Арутюновна — очный аспирант Научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России. Адрес: 344012, Россия, Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, д. 43/38/2. Телефон: 8 (989) 629-53-08. e-mail: arieshian@bk.ru; https://orcid.org/0000-0002-3042-6649

Гаджибекова Наина Балабековна — врач акушер-гинеколог, МБУЗ ГБСМП, Ростовская обл., г. Таганрог, https://orcid.org/0000-0003-3303-164X

Автор, ответственный за переписку: Дубровина Светлана Олеговна — НИИ акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России

Corresponding autor: Dubrovina Svetlana Olegovna — Scientific research institute of obstetrics and pediatrics of Rostov state medical university, Rostov, Russia

Авторы, ответственные за переписку: Андреева Елена Николаевна, тел.: 8(916)127-02-68; e-mail: endogin@mail.ru