Значимость проблемы мужского бесплодия в современном обществе возрастает с каждым годом. По данным ЕАU 2015 г., доля мужского фактора составляет 50% в структуре бесплодия [1]. При проведении только стандартного анализа эякулята, включающего оценку концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов, мужской фактор часто остается невыявленным [2—6]. Так, по данным A. Agarwal [7], до 15% мужчин с доказанным мужским фактором имеют нормальные параметры спермограммы. Для оценки функциональной состоятельности сперматозоидов были разработаны дополнительные тесты, такие как тест связывания с гиалуроновой кислотой (НВА-тест) и оценка уровня фрагментации ДНК сперматозоидов [8]. В настоящее время опубликованы данные о положительных корреляционных связях между уровнем НВА-теста и прогрессивной подвижностью, а также морфологической целостностью сперматозоидов [9], низкой частотой хромосомных анеуплоидий [10].

По данным метаанализа 2012 г. (2969 супружеских пар), высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов приводит к значительному увеличению числа выкидышей у женщин [11]. Иммунологическая форма бесплодия, характеризующаяся увеличением уровня положительного МАР-теста, является значимой причиной бесплодия в браке [12]. Таким образом, проведение комплексного исследования эякулята позволяет дать более точный прогноз в отношении оплодотворяющей способности сперматозоидов и дальнейшего развития эмбрионов in vitro в рамках лечебных циклов ЭКО/ИКСИ.

Цель исследования — определить частоты встречаемости отклонений от референсных значений величин показателей в спермограмме и в дополнительных анализах эякулята у мужчин из бесплодных пар, охарактеризовать взаимосвязи выявленных нарушений.

Проанализированы результаты обследования 237 мужчин, обратившихся в ООО «Новосибирский центр репродуктивной медицины» за период 2014—2015 гг. В исследование не включали пациентов с азоо- или криптозооспермией. Средний возраст супружеской пары составил: у мужчин 34,4±0,5 года, у женщин 32,6±0,4 года, средний стаж бесплодия 4,7±0,3 года. Сбор и анализ эякулята проводили в соответствии с критериями ВОЗ 2010 г. [13]. Одномоментно регистрировали спермограмму, проводили оценку морфологии сперматозоидов по строгим критериям Крюгера; МАР-тест, НВА-тест (индекс зрелости сперматозоидов); анализ фрагментации ДНК сперматозоидов. Все анализы выполняли с помощью фазово-контрастного микроскопа NikonEclipse 50i (Япония).

Для подсчета количества лейкоцитов использовали набор для дифференциальной диагностики лейкоцитов в сперме LeucoScreen, FertiProN. V (Бельгия). Подсчет живых сперматозоидов проводили с помощью набора VitalScreen, FertiProN. V (Бельгия). Морфологические мазки окрашивали с помощью красителя фуксина Циля (Агат, Россия), Spermac Stain FertiProN. V (Бельгия). Для проведения MAР-теста использовали набор для определения антиспермальных антител класса IgG SpermMarIgGTest, FertiProN. V (Бельгия). Для проведения НВА-теста использовали набор для определения степени связывания сперматозоидов с гиалуроновой кислотой (hyaluron binding assay) HBA-тест, Оrigio (Дания). Для оценки степени фрагментации ДНК сперматозоидов использовали метод SCD (sperm chromatin dispersion) HaloSperm, Halotech (Испания), GoldCyto «GoldcytoBiotechcorp» (Китай) и метод окраски акридиновым оранжевым одноцепочечных разрывов ДНК сперматозоидов, которые определяли с использованием проточного цитометра Guava easy Cyte, «Merck» (США).

Нарушения в эякуляте фиксировали и обозначали следующим образом: нарушения жидкой части эякулята (повышение вязкости и/или уменьшение объема эякулята и/или увеличение времени разжижения эякулята); агглютинация (выявление слипания сперматозоидов); олигозооспермия (снижение концентрации менее 15 млн/мл и/или общего количества менее 39 млн); астенозооспермия (снижение подвижности сперматозоидов менее 32%, снижение подвижности в динамике через 2 ч, снижение степени подвижности менее 2); гемоспермия (эритроциты в эякуляте); лейкоспермия (лейкоциты более 1 млн/мл); некроспермия (снижение доли живых сперматозоидов менее 58%); тератозооспермия (снижение доли морфологически нормальных форм сперматозоидов менее 4% и/или повышение индексов дефектности сперматозоидов и/или тератозооспермии (более 1,6); нарушение МАР-теста (при уровне антител более 10%); нарушение НВА-теста (при величине связывания менее 80%); нарушение по уровню фрагментации ДНК (более 15%); технически невозможны — при невозможности выполнения каких-либо тестов вследствие низкой концентрации и/или подвижности сперматозоидов.

Статистический анализ проводили с использованием пакета статистических программ Statistica v.10.0 («StatSoftInc.», США). Для сравнительного анализа применяли критерий χ², для корреляционного анализа рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r). Минимальную вероятность справедливости нулевой гипотезы принимали при p<0,05. Сильную достоверную связь фиксировали при r>0,70; среднюю — при 0,50<r<0,69; умеренную — при 0,30<r<0,49; слабую — при 0,20<r<0,29.

Из всех образцов эякулята (n=237) отсутствие нарушений зарегистрировано только в 4,6% случаев (контрольная группа); нарушения в одном параметре (1-я группа) — в 17,7%; в двух параметрах (2-я группа) — в 22,4%; в трех параметрах (3-я группа) — в 23,2%; в четырех параметрах (4-я группа) — в 16,5%; в пяти параметрах (5-я группа) — в 8%; нарушения в шести и более параметрах (6-я группа) — в 3,8%; технически невозможно проведение анализов — в 3,8% случаев (рис. 1).

За последние 30 лет в связи с ростом числа случаев нарушений сперматогенеза, а также расширением диагностических возможностей выявляемость нарушений эякулята, снижающих фертильный потенциал, неуклонно растет. В 1985 г. были опубликованы данные о выявлении у мужчин из бесплодных пар в 70% случаев нормоспермии (проводили анализ количества и подвижности сперматозоидов), и была дана рекомендация необходимости оценки женского фактора перед проведением анализа эякулята [14]. В 2002 г. при проведении стандартного анализа эякулята (концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов) уже 77% мужчин из бесплодных пар имели отклонения в одном или нескольких параметрах эякулята и только у 23% были нормальные значения [2]. Полученные нами результаты свидетельствуют о нарушениях параметров эякулята у 95,4% мужчин из бесплодных пар, выявляемых при проведении комплексного анализа. Если учесть, что критериями исключения при формировании группы испытуемых являлись крипто- и азооспермия, то при включении в выборку этих мужчин процент патологии был бы еще выше.

У мужчин с выявленными нарушениями эякулята по исследованным параметрам (n=217) наиболее часто встречались астенозооспермия (65,4%) и наличие фрагментации ДНК сперматозоидов (62,7%), реже — тератозооспермия (47,0%) и снижение НВА-теста (37,3%). Около 20% нарушений представлено увеличением положительного МАР-теста и изменениями жидкой части спермы (19,8 и 24,9% соответственно); частота остальных видов нарушений составила 5% и менее (рис. 2).

Сравнительный анализ выраженности нарушений сперматогенеза продемонстрировал, что при увеличении числа нарушений возрастает степень их выраженности. Для параметров общей спермограммы отмечается снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов при нарастании числа нарушений, однако объем и рН эякулята сохраняются в пределах референсного диапазона во всех группах (табл. 1).

Анализ морфологии сперматозоидов также продемонстрировал ухудшение показателей при росте числа нарушений, однако снижение доли нормальных форм ниже референсного диапазона наблюдалось с 4-й группы и отмечалось для 5-й и 6-й групп (табл. 2).

Анализ значений МАР-теста показал повышение процента сперматозоидов, покрытых антиспермальными антителами — АСАТ (табл. 3),

Клинически АСАТ находят у 3—12% бесплодных мужчин [18]. Фертильность мужчин при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов снижена пропорционально доле подвижных гамет, покрытых АСАТ, и обусловлена функциональными нарушениями сперматозоидов: преждевременной гиперактивацией, нарушениями акросомальной реакции и повышением уровня фрагментации ДНК, связанными с окислительным стрессом [17].

Анализ величины НВА-теста также продемонстрировал ухудшение показателей при росте числа нарушений. При этом в 4-й и 5-й группах были выявлены пограничные значения, характеризующиеся снижением фертильного потенциала, которые достигли критических значений в 6-й группе (см. табл. 3). Известно, что уровень связывания с гиалуроновой кислотой положительно коррелирует с подвижностью и морфологией сперматозоидов и отрицательно — с уровнем фрагментации ДНК [9]. При низких значениях НВА-теста увеличивается процент потери беременности [19].

Уровень фрагментации ДНК сперматозоидов сохранил общую тенденцию к ухудшению при увеличении числа нарушений (см. табл. 3).

Важно отметить, что статистически достоверные более высокие значения по сравнению с показателем в контрольной группе зафиксированы, начиная со 2-й группы, и достигают максимума в 6-й группе (см. табл. 3). Фрагментация ДНК сперматозоидов влияет на ранние этапы эмбрионального развития, особенно на формирование бластоцисты, что оказывает влияние на частоту наступления беременности в циклах ЭКО/ИКСИ [20—23].

Наиболее часто встречающиеся сочетания нарушений параметров эякулята представлены в табл. 4.

Полученные результаты демонстрируют наибольшую частоту сочетания астенозооспермии и фрагментации ДНК, что согласуется с данными литературы [24]. Следует отметить, что при одном нарушении в параметрах эякулята частота встречаемости фрагментации ДНК в 1,6 раза выше, чем снижение подвижности сперматозоидов (42,9 и 26,2% соответственно). По современным данным именно увеличение фрагментации ДНК сперматозоидов ведет к нарушению раннего эмбриогенеза и снижает частоту наступления беременности и родов [11, 25].

Проведен корреляционный анализ показателей эякулята с количеством выявленных нарушений. Всего обнаружено 28 статистически достоверных корреляционных связей, из них 14 положительных и 14 отрицательных. Отрицательные корреляционные связи средней силы зафиксированы с подвижностью в динамике (r=–0,53; p<0,001) и долей живых сперматозоидов (r=–0,51; р=0,038); умеренной силы — с концентрацией (r=–0,35; p<0,001) и количеством сперматозоидов (r=–0,41; p<0,001), их общей (r=–0,33; p<0,001) и прогрессивной подвижностью (r=–0,47; p<0,001), морфологией (r=–0,49; p<0,001) и величиной НВА-теста (r=–0,47; p<0,001). Положительные корреляционные связи умеренной силы зафиксированы с фрагментацией ДНК (r=0,35; p<0,001), индексом тератозооспермии (r=0,38; p<0,001), индексом дефектности сперматозоидов (r=0,47; p<0,001) и патологией хвоста (r=0,34; p<0,001), а также вязкостью эякулята (r=0,39; p<0,001). Выявлена слабая положительная корреляционная связь с МАР-тестом (r=0,20; р=0,002) и отрицательная связь с объемом эякулята (r=–0,20; р=0,003). Не выявлено корреляционных связей числа нарушений в эякуляте со стажем бесплодия, длительностью воздержания, рН, временем разжижения. Проведенный корреляционный анализ подтверждает заключение о связи исследованных проявлений патологии эякулята с числом нарушений.

Таким образом, полученные результаты показали, что обоснованное заключение о нормозооспермии возможно сделать только после проведения комплексного исследования эякулята. Необходимо расширение спектра обязательного обследования и включения в него исследований уровня фрагментации ДНК сперматозоидов и НВА-теста. Проведение этих анализов в дополнение к стандартному анализу эякулята будет способствовать выявлению разных уровней нарушения строения и функционирования сперматозоидов и поможет избежать увеличения сроков диагностики причин бесплодия, осуществить проведение патогенетически обоснованной терапии и увеличить число успешных исходов лечения бесплодия.

1. Вероятность выявления нормозооспермии при комплексном подходе к обследованию мужчины из бесплодной пары составляет менее 5%.

2. Отмечено преобладание множественных нарушений над единичными нарушениями и нормальными параметрами, наиболее часто встречаются нарушения в трех или двух параметрах эякулята, что составляет более 45% всех случаев нарушений.

3. У мужчин с нарушениями в параметрах эякулята наиболее часто встречаются астенозооспермия и наличие фрагментации ДНК сперматозоидов, реже — тератозооспермия и снижение НВА-теста, затем повышение МАР-теста и изменения жидкой части спермы; частота остальных видов нарушений составляет 5% и менее.

4. Выраженность нарушений сперматогенеза возрастает при увеличении числа нарушений параметров эякулята.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.Е., В.С.

Сбор и обработка материала — Е.К., Е.Л., Е.Г., В.А., Е.Е.

Статистическая обработка данных — Е.Е., И.М.

Написание текста — Е.Е., В.С.

Редактирование — В.С., И.М., В.А.

Сведения об авторах

Епанчинцева Елена Александровна [EpanchintsevaElenaAleksandrovna]ФГБНУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины», Новосибирск, Россия, 630117; ООО «Новосибирский центр репродуктивной медицины» группа компаний «Мать и дитя», Новосибирск, Россия, 630037

Селятицкая Вера Георгиевна[SelyatitskayaVeraGeorgievna] ORCID 0000-0003-4534-7289; тел. 7 (962) 8393589; е-mail: ccem@centercem.ru

Митрофанов Игорь Михайлович [MitrofanovIgorMikhailovich]; е-mail: mim07@mail.ru

Артюхова Виктория Геннадьевна[ArtuchovaVictoriaGennadievna], е-mail: vvictorias@hotmail.com

Лебедева Евгения Марковна [LebedevaEvgeniaMarkovna], е-mail: amgncrm@yandex.ru

Галустян Елена Алексеевна [GalustynElenaAlekseevna], е-mail: amgncrm@yandex.ru

Кирс Ева Юрьевна[KirsEvaYurevna], е-mail: amgncrm@yandex.ru