Сравнительная оценка уровня ДНК-фрагментации и других показателей фертильности эякулята

В настоящее время установлено, что дефекты ДНК сперматозоидов ассоциированы с мужским бесплодием и различными нарушениями гестационного процесса, в частности, с невынашиванием беременности [1]. Негативное влияние оказывает патология спермальной ДНК на течение беременности при использовании вспомогательных репродуктивных технологий — внутриматочных инсеминаций, ЭКО и ИКСИ [2—4].

Во многих работах исследовались коррелятивные связи между индексом фрагментации (ИФ) ДНК, подвижностью и морфологией сперматозоидов, однако отмечается противоречивость полученных результатов. Некоторые авторы констатируют отсутствие существенной зависимости между ИФ ДНК и традиционными показателями спермиологического анализа [5, 6]. Кроме того, примерно 25—40% бесплодных мужчин с нормальными стандартными показателями спермограммы имеют высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов, которая резко подавляет их фертилизационный потенциал [7]. В значительном числе исследований [8—10] показано, что при различных вариантах патоспермии наблюдается заметное увеличение ИФ.

Оценка акросомальной реакции (АР) крайне редко используется при проведении спермиологического анализа и выборе тактики ВРТ. L. Gianaroli и соавт. [11] показали, что использование для ИКСИ сперматозоидов с уже индуцированной АР существенно улучшает качество эмбрионов. Однако нам не удалось обнаружить работ, посвященных изучению влияния повреждений хроматина на акросомальный экзоцитоз сперматозоида.

Цель настоящей работы — изучение корреляции между уровнем ДНК фрагментации сперматозоидов и другими показателями фертильности эякулята.

Проведено сравнительное исследование проб эякулята 56 мужчин, состоящих в бесплодном браке. Критериями их отбора служило отсутствие в анамнезе и по данным обследования аномалий кариотипа, микроделеций Y-хромосомы и непроходимости семявыносящих путей. Возраст пациентов варьировал от 22 до 48 лет (средний возраст 32,5±3,3 года). У 32 пациентов выявлены астенозооспермия и у 24 — нормальная подвижность гамет. Длительность бесплодия колебалась от 1 года до 10 лет. Доля мужчин со вторичным бесплодием равнялась 21,4% (n=12).

Спермиологический анализ эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ [12]. Окрашивание сперматозоидов осуществляли набором Sperm stain («Ferti Pro N.V.», Бельгия). Концентрацию морфологически нормальных форм (индекс Крюгера, ИК) определяли в соответствии с критериями T. Кruger и соавт. [13]. Для оценки ДНК-фрагментации использован набор Halosperm («Indas», Испания). Индуцируемость А.Р. определяли с помощью метода, основанного на применении ионофора и меченного коллоидным золотом лектина Pissumsativum [14]. Содержание сперматозоидов, позитивных по IgG антиспермальным аутоантителам, выявляли методом МАР (mixed antiglobulin reaction) («Ferti Pro N.V.», Бельгия).

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием методов вариационной статистики с помощью пакетов программ Excel 2010 («Microsoft») и Statistica 7 («StatSoft»). Данные представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение среднего. Применяли также корреляционный метод Спирмена и критерий Манна—Уитни.

Величина ИФ у обследуемых пациентов варьировала в широком диапазоне от 2 до 68% (11,2±2,8%). Границы нормы этого показателя у разных авторов [7, 15, 16] находятся в пределах 10—15%, что зависит в значительной степени от метода исследования повреждений хроматина.

Положительный МАР-тест (более 40%) выявлен у 2 (3,6%) пациентов.

Уровень ДНК-фрагментации превышал 15% у 9 пациентов с астенозооспермией и только у 3 с нормозооспермией. Средний уровень ИФ при астенозооспермии был достоверно выше, чем при нормозооспермии: 13,2±2,2 и 8,5±1,1% соответственно (р=0,0232). Выявлена сильная обратная корреляция между величиной этого индекса и удельным содержанием прогрессивно-подвижных сперматозоидов категории, А (r= –0,6013; р=0,0029) (см. рисунок и таблицу). Столь же значительная связь имела место между подвижностью и ИК (r=–0,4380; р=0,0013).

В группе пациентов (n=20) с ИК, равным 13% и менее, уровень ИФ был более 15% у 6 мужчин, тогда как при высоком ИК (у 36 пациентов) выраженная степень изменений спермальной ДНК зафиксирована только у 2 мужчин. Средний уровень ИФ в данных подгруппах достоверно различался: 13,9±3,2 и 8,6±0,8% соответственно (р=0,0488). Корреляционная зависимость между ИФ и ИК была средней выраженности (r=–0,1808; р=0,0372) (см. таблицу).

Слабая индуцируемость АР (индекс АР менее 14%) имела место у 11 (55,0%) из 20 пациентов с низким ИК, тогда как из 36 пациентов с высоким ИК она наблюдалась только у 4 (11,1%) пациентов (р=0,0172). Коэффициент корреляции между АР и ИК составил 0,4003 (р=0,0036). Обнаружена также выраженная зависимость между АР и подвижностью сперматозоидов (категория А): r=0,3063; р=0,0288.

В группе пациентов (n=14) с низкой индуцируемостью АР показатель ИФ был несколько выше, чем у пациентов (n=42) с нормальным акросомальным экзоцитозом: 16,0±5,9 и 9,9±0,9% соответственно (р=0,1020). Однако корреляция между индексом АР и ИФ была крайне слабой (r=–0,0808; р=0,0573) (см. таблицу).

Взаимосвязи между ИФ, показателями МАР-теста и объемом эякулята выявить не удалось (см. таблицу).

Нам удалось подтвердить данные многих исследователей [8, 9, 17] о наличии cильной корреляционной связи между уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов и концентрацией подвижных сперматозоидов при мужском бесплодии.

В качестве высокоинформативного показателя морфологического состояния сперматозоидов мы использовали И.К. Ранее было показано, что при тератозооспермии часто наблюдается увеличение ИФ сперматозоидов [9, 10]. Наблюдалось достоверное повышение ИФ в группе пациентов с низким уровнем Крюгера. В работе Ю.И. Шеиной и соавт. [8] была выявлена сильная корреляция между процентом морфологически нормальных форм сперматозоидов и И.Ф. Однако нам удалось обнаружить только умеренную корреляцию между этими показателями.

Многие авторы [8, 18] не выявили взаимосвязи ИФ и концентрации антиспермальных аутоантител, что согласуется с результатами нашего исследования.

Индуцируемость АР практически не коррелировала с величиной И.Ф. Это объясняет данные литературы о том, что частота наступления беременности в программах ЭКО/ИКСИ не различалась в группах с высоким и низким ИФ ДНК. В супружеских парах, где мужчины имели высокий уровень фрагментации ДНК (30%), была низкая частота формирования бластоцист (<30%) и также повышенная вероятность абортов [20]. Ранее было показано, что удаление с помощью магнитной сорбции сперматозоидов, несущих на мембране маркеры апоптоза, существенно увеличивает их фракцию с высокой индуцируемостью АР [19]. Поэтому, если более высокое качество гамет, взятых для ИКСИ с «запущенной» АР, обусловлено, по-видимому, отсутствием или слабой выраженностью у них апоптотических изменений, то ДНК-фрагментация, окисление липидов мембран и активация кислородных радикалов митохондрий, как и другие изученные нами показатели морфофункционального состояния гамет, являются именно отражением утраты ими жизнеспособности в рамках естественной инволюции или патологических изменений при тех или иных заболеваниях мужской половой системы.

Таким образом, чем меньше подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов в эякуляте, тем больше вероятность повышенной частоты фрагментации ДНК. Сила коррелятивных связей между ИФ и различными параметрами фертильности эякулята снижается в ряду: подвижность сперматозоидов, удельное содержание их морфологически нормальных форм, интенсивность А.Р. Именно это позволяет использовать показатель фрагментации ДНК сперматозоидов в качестве предиктора течения беременности в рамках ВРТ.