Апоптоз - чрезвычайно интересный биологический феномен - является основным механизмом гибели половых клеток в течение нормального сперматогенеза и в свою очередь главным механизмом в регуляции сперматогенеза у различных видов млекопитающих, включая человека [1]. Выявлено, что в яичках здоровых мужчин происходит спонтанный апоптоз сперматогониев, сперматоцитов и сперматид [2]. Однако и эякуляторные сперматозоиды обнаруживают признаки апоптоза [3], и ряд авторов [4-6] описывают присутствие маркеров апоптоза, таких как экстернализация фосфатидилсерина (ФС), Fas-экспрессия, увеличение активности каспаз, фрагментация ДНК в сперматозоидах фертильных мужчин и при нарушениях сперматогенеза.

По данным литературы [7, 8], у мужчин с различными параметрами спермограммы в среднем 20% эякуляторных сперматозоидов имеют признаки апоптоза при исследовании с использованием как аннексинового метода (для выявления экстернализации ФС), так и метода TUNEL (для выявления фрагментации ДНК).

В то же время до настоящего времени не ясно, являются ли апоптотические маркеры эякуляторных сперматозоидов результатом «абортивного» апоптотического процесса, начавшегося до эякуляции во время сперматогенеза [9], или они служат признаком апоптоза, инициированного в постэякуляторный период [10]. «Абортивный» апоптотический процесс может быть связан с преждевременным уходом сперматид на ранних стадиях апоптоза от клеток Сертоли, которые, как правило, в норме должны активно участвовать в элиминации таких клеток.

C. Lachaud и соавт. [11] проведена оценка двух способов гибели человеческих эякуляторных сперматозоидов - апоптоза и некроза среди свежевыделенных сперматозоидов и после 24 ч инкубации in vitro, используя аннексиновый и TUNEL-методы. Авторы выявили, что эякуляторные сперматозоиды здорового человека не запускают процесс апоптоза в условиях in vitro и их гибель осуществляется чаще всего путем некроза, а не апоптоза. Таким образом, присутствие апоптических маркеров в эякуляторных сперматозоидах является следствием процессов, начатых до эякуляции, что подтверждает теорию «абортивного апоптоза».

Как известно, в мужском организме местом сперматогенеза являются яички, но после созревания, уже на посттестикулярном уровне, нормальные сперматозоиды могут подвергаться физиологическим или нефизиологическим повреждениям. Так, если сперма долгое время находится в эпидидимисе, который служит хранилищем сперматозоидов в течение 12-14 дней и местом дальнейшего морфологического, биохимического и физиологического дозревания сперматозоидов, то, например, в случаях абстиненции (воздержания) или анэякуляции (отсутствия семяизвержения во время полового акта при сохранении нормального семяобразования, полового влечения и эрекции) или при затрудненном ее продвижении, обструкции семявыносящих путей сперматозоиды стареют или могут подвергаться воздействию повышенного уровня активных форм кислорода (ROS, или АФК) в течение длительного периода перед эякуляцией [12, 13]. ROS (АФК) - известный индуктор апоптоза в соматических клетках [14] и в созревших сперматозоидах на тестикулярном уровне [15]. Повреждения, которые получаются при хранении сперматозоидов, называются эффектом старения, или сверхзрелости, отражающимся на степени конденсации хроматина и на способности генома давать нормальное эмбриональное развитие. Известно, что при оплодотворении несвежими сперматозоидами у животных увеличивается эмбриональная смертность, а у абортированных зародышей наблюдали хромосомные аномалии. В экстрактах из старых сперматозоидов животных обнаружено увеличение содержания антигенов [12].

Деструкция и элиминация стареющих или патологических форм сперматозоидов происходит путем апоптоза, благодаря утилизирующей способности эпителия придатка, и важную роль в этом процессе играют спермиофаги. Однако при эякуляции из хвоста эпидидимиса сперматозоиды выходят не гомогенной популяцией, а разными по степени созревания [12], поэтому в эякулированной сперме имеется некоторый процент не только атипичных, но и нормальных сперматозоидов, находящихся в начале или на различных стадиях старения и апоптоза. Старение сперматозоидов и запущенный в них процесс апоптоза особенно важно учитывать в практике вспомогательных репродуктивных технологий при проведении процедур искусственного оплодотворения.

Кроме того, сперматозоиды могут подвергнуться апоптозу при действии агентов различной природы, входящих в состав секрета придаточных половых желез при слиянии с ним в момент эякуляции. Таким образом, непонятно, каков же процент истинно «абортивных» апоптотических сперматозоидов [16] среди общего числа сперматозоидов с признаками апоптоза в эякулятах фертильных мужчин.

Поэтому целью настоящего исследования было выявить долю «абортивных» апоптотических сперматозоидов среди общего числа сперматозоидов с признаками апоптоза в эякулятах фертильных мужчин.

В исследовании приняли участие 18 здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 22 до 40 лет, заключивших договор на возмездной основе и от которых было получено информативное согласие на проведение исследований.

Сбор эякулята проводили по следующей схеме:

1) 1-й день - 1 раз - контрольный образец;

2) 2, 3, 4, 5, 6-й день - по 3 раза в день с интервалом 6 ч между каждым разом.

Образцы эякулята были собраны мастурбацией в стерильные пластмассовые стаканчики. Сбор эякулята в 1-й день (контроль) производился после 72 ч сексуального воздержания. В течение 30 мин при комнатной температуре (22 °C) эякуляты были оставлены для разжижения, после чего каждый образец разделялся на две части: один для анализа функциональных и цитологических параметров, другой - для оценки апоптоза. Измерение показателей стандартной спермограммы (концентрации, подвижности, жизнеспособности и морфологии сперматозоидов) проводили в соответствии с рекомендациями и нормативами Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [17, 18], согласно которым все исследованные нами образцы эякулятов были отнесены к фертильным.

У обследуемых доноров обнаружение клеток сперматогенеза (сперматогоний, сперматоцитов и сперматид), эпителиальных клеток, лейкоцитов входило в понятие «круглые клетки», и средняя величина данного показателя была в норме и не превышала 1 000 000 клеток в 1 мл, что говорит об отсутствии острых воспалительных процессов (или лейкоцитоспермии) у обследованных мужчин [17, 18].

Известно, что у мужчин с возрастом, особенно после 50-55 лет, ухудшаются количественные и качественные показатели эякулята, в частности, это касается доли прогрессивно подвижных спермиев и появления большей доли старых сперматозоидов с дефектами ДНК [19]. В нашем исследовании средний возраст мужчин достоверно не различался и составил 32,5±2 года (от 22 до 40 лет). Это позволяет не учитывать влияние возрастного аспекта на параметры спермы.

Сперматозоиды выделяли из образцов эякулятов методом простого отмывания от семенной плазмы фосфатно-солевым буфером pH 7,4.

Выявление сперматозоидов с признаками апоптоза проводили аннексиновым методом: для обнаружения экстернализации ФС использовали инкубацию отмытых сперматозоидов (1×10⁶) при температуре 37 °С в течение 10 мин с аннексином V-FITC и йодидом пропидия - PI («Becton Dickinson»), согласно инструкции изготовителя. Мазки исследовались на флюоресцентном микроскопе под иммерсионным объективом ×100.

Выявление экспрессии рецептора апоптогенного сигнала на клетках - Fas [20] проводили соответствующими моноклональными антителами, конъюгированными с фикоэритрином (CD95-РЕ, IgG1, Caltag Lbs.), согласно инструкции производителя, с последующей флюоресцентной микроскопией.

Результаты оценивали следующим образом: не­окрашенные клетки (AnV–/PI–) оценивались как жизнеспособные; сперматозоиды, окрашенные только аннексином-V (AnV+/PI–) или окрашенные и аннексином-V и PI (AnV+/PI+), оценивались как апоптотические; сперматозоиды, окрашенные только PI (AnV–/PI+), - как некротические. Выявление экспрессии рецептора апоптогенного сигнала Fas на клетках не считали доказательством апоптоза, а расценивали как потенциальную готовность клетки к Fas-зависимому апоптозу.

Анализ спермограмм доноров позволил выявить следующую закономерность: с увеличением частоты эякуляций уменьшался объем эякулята и концентрация сперматозоидов, увеличивалось число сперматозоидов с цитоплазматической каплей. Сравнение кинетических показателей сперматозоидов дало основание сделать вывод о том, что при ежедневных эякуляциях в сперме обследованных мужчин увеличивалась доля прогрессивно подвижных спермиев.

Выявлено, что в 1-й день забора эякулята доноров среди свежевыделенных сперматозоидов число клеток с признаками апоптоза (с экстернализацией ФС, визуализированной по связыванию с анне­ксином-V, т.е. аннексин-V-положительных) составляет в среднем 10% [10,05±0,4% (9,30-11,0%)]. У 14 (78%) из 18 фертильных мужчин менее 10% свежевыделенных сперматозоидов [–3,96±0,83% (2,21-5,71%)] оказались Fas-положительными. При этом у 22% мужчин экспрессия Fas-антигена на сперматозоидах не обнаружена.

Корреляционный анализ показал, что взаимо­связи содержания аннексин-V-положительных и Fas-положительных сперматозоидов в контрольных образцах, полученных в 1-й день эксперимента, не выявлено (r=0,1). Это лишний раз является подтверждением того, что экспрессия Fas-рецептора на клетках не является доказательством апоптоза, а свидетельствует лишь о потенциальной готовности клетки к Fas-зависимому апоптозу.

При анализе изменения содержания аннексин-V-положительных сперматозоидов в сперме 18 мужчин в зависимости от частоты эякуляции выявить общую закономерность изменения не удалось, но зато удалось выявить следующие особенности, в соответствии с которыми все мужчины были разделены на группы: у 6 (33%) из 18 мужчин содержание клеток с признаками апоптоза (AnV+) имело тенденцию к снижению (1-я группа); у 4 (22%) мужчин содержание в эякулятах аннексин-V-положительных сперматозоидов достоверно не изменялось (2-я группа); у 8 (44%) мужчин изменения имели колебательный характер с каждой эякуляцией (3-я группа). Данные представлены на рис. 1.

Так, у 6 мужчин 1-й группы количество сперматозоидов с признаками апоптоза (AnV+) в контрольных образцах составляло 9,75±0,4%, затем с каждой последующей эякуляцией имело плавную тенденцию к снижению, а с восьмой эякуляции (4-й день забора эякулята) происходило резкое уменьшение доли апоптотических клеток (AnV+) в 2,2 раза (р<0,05), после чего достоверных изменений не наблюдалось, уровень таких клеток в эякулятах стабилизировался и составлял в среднем 4,50±0,13%. Таким образом, этот уровень следует считать уровнем «абортивного» апоптоза сперматозоидов у данных пациентов, а разница в 5,25±0,8% есть апоптоз, возникший на посттестикулярном уровне в результате воздействия повреждающих факторов различной природы.

У 4 мужчин 2-й группы содержание аннексин-V-положительных сперматозоидов в контрольных образцах составляло 9,58±1,5% и на протяжении всех последующих эякуляций статистически значимых различий в количестве (8,84±0,1%) таких клеток (AnV+) не наблюдалось (р>0,05).

Доноры 3-й группы (n=8) имели средний уровень AnV+ сперматозоидов (10,50±0,62%) в контрольных образцах, который скачкообразно изменялся в сторону как уменьшения, так и увеличения, однако в среднем во всех порциях эякулята составил 8,23±0,4%, что меньше по сравнению с контрольным (р<0,05).

При анализе изменения содержания Fas-положительных сперматозоидов в сперме обследованных мужчин в зависимости от частоты эякуляции выявить общую закономерность изменения также не удалось, как и в случае с аннексин-V-положитель­ными сперматозоидами, а выявленные особенности, в соответствии с которыми все мужчины были разделены на группы, выглядели следующим образом. Исходя из того, что Fas-антиген был экспрессирован на сперматозоидах лишь 14 фертильных мужчин, то у 3 из них содержание в эякуляте Fas-положительных клеток имело тенденцию к снижению (1-я группа); у 4 мужчин содержание в эякулятах Fas-положитель­ных сперматозоидов достоверно не изменялось (2-я группа); у 7 мужчин изменения имели колебательный характер с каждой эякуляцией (3-я группа). Данные представлены на рис. 2.

У 3 мужчин 1-й группы количество Fas-положительных сперматозоидов в контрольных образцах эякулята составляло 6,0±2,0%, а с пятой эякуляции (3-й день забора эякулята) происходило достоверное снижение (в 1,6 раза) доли таких клеток до 3,72±0,1% (р<0,05), и этот уровень с каждой следующей эякуляцией достоверно не изменялся. Скорее всего, эти маркированные Fas-антигеном сперматозоиды были предрасположены при наличии дополнительных факторов к смерти через апоптоз, но избежали его на уровне сперматогенеза. Видимо, у 2,28±1,94% спермиев данных пациентов экспрессия Fas-антигена происходила на посттестикулярном уровне.

Контрольные образцы эякулятов 4 мужчин 2-й группы содержали 2,93±0,9% Fas-положительных сперматозоидов и на протяжении всех последующих эякуляций этот уровень сохранялся (р>0,05) и составлял 3,19±0,1%.

В контрольных образцах эякулятов 7 мужчин 3-й группы средний уровень Fas-положительных половых клеток составил 5,94±1,25%, однако этот уровень с каждой следующей эякуляцией изменялся либо в сторону уменьшения, либо в сторону увеличения и в среднем за все эякуляции составил 4,72±0,42%, но различия оказались недостоверны по сравнению с контрольными образцами (р>0,05).

У 2 из 18 доноров с каждой последующей порцией эякулята наблюдалась одинаковая тенденция одновременного уменьшения процентного содержания в эякуляте сразу обоих маркеров апоптоза - и экстернализации ФС, и экспрессии Fas-рецептора. У одного донора из всех обследованных уровень и аннексин-V-положительных, и Fas-положительных сперматозоидов не изменялся на протяжении всех эякуляций.

Таким образом, при частых эякуляциях в сперме более чем половины обследованных здоровых мужчин наблюдалось достоверное снижение уровня сперматозоидов с признаками апоптоза (аннексин-V-положительных), что дало возможность выявить у этих доноров долю «абортивного» апоптоза.

Сперматогенез является динамическим процессом, затрагивающим митотические деления сперматогоний, мейотические деления сперматоцитов, морфологическую дифференцировку и созревание сперматид, и наконец, формирование сперматозоидов [1]. Этот процесс ведет к клональному увеличению числа мужских половых клеток и должен быть нейтрализован механизмом, способным контролировать перепроизводство мужских гамет. Элиминация половых клеток путем апоптоза в ходе сперматогенеза является нормальным постоянным процессом, приводящим к уменьшению числа потенциально возможных сперматозоидов [1, 21, 22]. Подсчитано, что около 75% клеток-предшественников сперматозоидов элиминируется в процессе их созревания, преимущественно за счет апоптоза [23].

Несомненно, что для сперматогенеза млекопитающих и человека характерны высокая степень упорядоченности процесса в пространстве и времени, наличие определенной зависимости в разной степени дифференцированных половых клеток друг от друга, что делает его крайне чувствительным к действию повреждающих агентов, которые не влияют на синхронность развития клеток сперматогенного эпителия, но вызывают их гибель и деструкцию семенных канальцев [12, 24, 25].

Сперматозоиды, в которых был запущен процесс программируемой гибели, но не был до конца завершен (неполный апоптоз или «абортивний апоптоз»), могут попадать в эякулят. Такие сперматозоиды могут иметь нарушения целостности ДНК, и при попадании в яйцеклетку этот сперматозоид не способен будет обеспечить нормальное развитие [26].

Как известно, после эякуляции эпидидимис не полностью освобождается от сперматозоидов, некоторое их количество остается в нем со времени предыдущей эякуляции [12]. Поэтому популяция эякулированных сперматозоидов является гетерогенной, так как в нее попадают как сперматозоиды, длительное время находившиеся в эпидидимисе, так и сравнительно недавно вышедшие из семенников, т.е. с разной степенью зрелости. Это влияет на возраст и качество сперматозоидов в эякуляте и, как следствие, на содержание в эякуляте сперматозоидов в состоянии апоптоза. Масштабы этого влияния трудно установить, и оно редко принимается во внимание. Однако особенно в случаях нарушения фертильности эякулята [27, 28], вследствие увеличения доли сперматозоидов с признаками апоптоза в сперме [29] актуальным становится выявление истинной доли «абортивного» апоптоза. Такие данные позволят повысить информативность исследования причин нарушения фертильности эякулята, а также сократить группу так называемого идиопатического бесплодия у мужчин.

В ходе проведенного исследования, несмотря на различную тенденцию в изменениях количества апоптотических клеток в эякулятах фертильных мужчин, нам удалось показать, что при частых эякуляциях в сперме можно выявить долю так называемого «абортивного» апоптоза сперматозоидов среди общего числа сперматозоидов с признаками апоптоза. Сперматозоиды могут стареть и подвергаться апоптозу или подвергаться апоптозу вследствие воздействия повреждающих агентов как на уровне эпидидимиса, так и при слиянии с секретом придаточных половых желез в момент эякуляции. Разница между количеством апоптотических клеток в контрольной порции эякулята (после 72 ч сексуального воздержания) и в порции после нескольких каждо­дневных эякуляций, как в случае с 1-й группой пациентов, на наш взгляд, позволяет заключить, что у этих мужчин на посттестикулярном уровне созревшие половые клетки подвергаются воздействию повреждающих факторов. Выявление этих факторов может представлять интерес для диагностического использования в практической андрологии, так как в случае с субфертильными пациентами может помочь лечащему врачу в выборе тактики терапии. Полученные данные могут также представлять практический интерес при подготовке спермы для вспомогательных репродуктивных технологий.