В последнее время активно исследуется ядерный фермент поли(АДФ-рибозо)полимераза-1 (ПАРП-1), что обусловлено как его важной физиологической ролью, так и участием в патогенезе ряда заболеваний, в том числе аутоиммунных [1—4]. ПАРП-1 — наиболее распространенная изоформа из 17 ферментов семейства поли(АДФ-рибозо)полимераз, локализуется в ядрах всех клеток, активируется при разрывах ДНК и осуществляет посттрансляционную модификацию белков. Фермент, используя НАД⁺ в качестве субстрата, синтезирует цепочки полимера АДФ-рибозы и присоединяет их к гистонам, белкам репарации ДНК, транскрипционным факторам и т.д. При умеренном генотоксическом стрессе ПАРП-1 способствует репарации ДНК и поддерживает стабильность генома [5—7]. Показана важная роль фермента в репродуктивной функции, в том числе в гаметогенезе [2, 8—10]. ПАРП-1 экспрессируется в ооцитах и фолликулярных клетках, причем уровень его экспрессии изменяется в ходе фолликуло- и оогенеза [8, 9].

При чрезмерной активации проявляется патогенетическая роль ПАРП-1. Этот фермент при оксидативном стрессе, ишемии и повреждении ДНК является ключевым медиатором клеточной гибели, связанной с высвобождением митохондриального апоптозиндуцирующего фактора (АИФ) [3, 7, 11]. Истощение клеточных энергетических ресурсов (НАД⁺ и АТФ) в результате гиперактивации ПАРП-1 приводит к повреждению мембран и гибели клеток по провоспалительному и иммуногенному некротическому пути [1, 4, 12]. Участие ПАРП-1 в развитии заболеваний опосредуется также экспрессией провоспалительных генов, поскольку этот фермент является коактиватором провоспалительных факторов NF-kB, АР-1 и др. [3, 4, 6, 13]. Исследования на экспериментальных моделях ряда заболеваний, в том числе аутоиммунных, показали выраженный протективный эффект применения ингибиторов ПАРП [4, 11—14]. Это послужило основой для фармакологического воздействия на ПАРП при различных воспалительных болезнях, хотя в настоящее время большинство клинических испытаний ингибиторов этого фермента направлено на лечение онкологических заболеваний. Один из механизмов противоопухолевой активности ингибиторов ПАРП опосредован тем, что подавление активности этого фермента приводит к неспособности некоторых типов раковых клеток репарировать поврежденную химио- или радиотерапией ДНК и к их гибели [2, 6, 12, 15].

Известно, что в патогенезе многих заболеваний органов репродуктивной системы, в том числе яичников, существенную роль играют иммуновоспалительные процессы. Происходит активация клеток естественного и адаптивного иммунитета, возрастает синтез провоспалительных молекул (цитокинов, хемокинов, молекул адгезии, эйкозаноидов, оксида азота и других факторов). Увеличивается лейкоцитарная инфильтрация поврежденных тканей, продуцируется большое количество активных форм кислорода и азота. Это может приводить к генотоксическому стрессу с повреждением ДНК и к усилению гибели клеток как поврежденных органов, так и инфильтрирующих иммуноцитов, что в свою очередь вызывает активацию ПАРП-1 с соответствующими последствиями физиологического либо патологического характера [2, 12, 13, 15]. Кроме того, этот фермент участвует в пролиферации и дифференциации иммунокомпетентных клеток (ИКК) [4]. Однако роль ПАРП-1 при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы практически не изучена. По нашим данным [14], ингибитор ПАРП 3-аминобензамид (3-АБА) оказывал протективное действие на оогенез и способствовал ослаблению воспалительных процессов у мышей в условиях моделирования иммунного повреждения яичников. При этом уменьшалась гибель как фолликулярных клеток, так и ИКК. Однако следует отметить, что 3-АБА не является сильным и селективным ингибитором ПАРП-1 и дает неспецифический антиоксидантный эффект [6, 15]. Поэтому исследование ПАРП-1-опосредованных механизмов иммунного воспаления, а также оценка перспективности данного фермента, как мишени для терапевтических воздействий, требует применения более мощных и специфических ингибиторов ПАРП [7, 13, 15, 16], таких как 4-гидроксиквиназолин (4-ГК).

Цель настоящей работы — изучить действие 4-ГК — ингибитора ПАРП-1 на оогенез и пути клеточной гибели при экспериментальном иммунном повреждении яичников у мышей.

Исследования проведены на половозрелых самках мышей линии СВА массой 18—20 г. При работе с животными были соблюдены положения Конвенции по биоэтике Совета Европы (Страсбург, 1997).

Иммунное повреждение яичников мышей вызывали иммунизацией тканью аллогенных яичников. Водно-солевой экстракт получали путем гомогенизации яичников белых лабораторных мышей в холодном физиологическом растворе и последующего центрифугирования при 1000 g в течение 7 мин. Супернатант использовали для иммунизации в качестве антигена. На первом этапе проводили подкожное введение водно-солевого экстракта яичников (2 мг белка на 20 г массы мыши) в полном адъюванте Фрейнда. В дальнейшем (через 7 дней после иммунизации с адъювантом) внутривенно вводили возрастающие дозы антигенного материала (0,5, 0,75 и 1,0 мг белка на мышь массой 20 г) через 2 сут на 3-и. Через 6 сут после последней иммунизации проводили исследования яичников, тимуса, лимфоузлов и селезенки.

4-ГК (4-hydroxyquinazoline, «Sigma-Aldrich», США) растворяли в физиологическом растворе при слабом нагревании и вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг на 1 кг массы мыши на протяжении всего периода иммунизации. Инъекции 4-ГК (всего 6) выполняли за 2 ч до каждого введения антигена, а также через 3 cyт после первой и последней иммунизации.

Исследования проведены на трех группах животных: 1-я группа — иммунизация тканью аллогенных яичников по вышеприведенной схеме + интраперитонеальное введение физиологического раствора в соответствующем объеме; 2-я группа — иммунизация + интраперитонеальное введение 4-ГК; 3-я группа — контроль: введение физиологического раствора (вместо антигена) по схеме иммунизации + интраперитонеальная инъекция физиологического раствора по схеме введения 4-ГК.

Для оценки мейотического созревания ооцитов из яичников стерильно выделяли зрелые фолликулы (большие фолликулы, которые содержали много слоев фолликулярных клеток и яйцеклетку с выраженной прозрачной оболочкой) и подсчитывали их количество. Кумулюсно-ооцитарные клеточные комплексы культивировали на протяжении 20 ч в среде ДМЕ с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки при 37 °С. После 4 ч культивирования подсчитывали ооциты (в % от общего числа), которые пребывали на стадии метафазы I (растворение зародышевого пузырька), а после 20 ч — на стадии метафазы II (формирование первого полярного тельца).

Для исследования клеточной гибели выделяли клетки тимуса, селезенки и лимфоузлов по общепринятой методике механической диссоциации. Иммунокомпетентные органы диспергировали в среде выделения (забуференном фосфатами физиологическом растворе — ЗФР) с помощью ножниц и мягкого пипетирования (тимус и паховые лимфоузлы) или в стеклянном гомогенизаторе (селезенка). Клетки 2 раза отмывали центрифугированием в ЗФР (500 g, 7 мин). В полученной суспензии клеток селезенки проводили лизис эритроцитов на протяжении 20 с в дистиллированной воде с последующим восстановлением осмолярности среды. Большинство клеток (более 90%) в полученных суспензиях составляли лимфоциты, как было выявлено при их окрашивании по Паппенгейму.

Оценку апоптоза и некроза проводили по морфологическим признакам, что считается «золотым стандартом» исследования клеточной гибели. Количество живых, некротических и апоптотических клеток тимуса, селезенки и лимфоузлов подсчитывали после прижизненного окрашивания флюоресцентными ядерными красителями (Хехст 33422 и пропидиум йодид) сразу после выделения клеток [17]. Пропидиум йодид проникает только в клетки с нарушенными мембранами (т.е. в некротические) и окрашивает их ядра в оранжевый цвет. Краситель Хехст 33422 проникает через неповрежденные мембраны и окрашивает ядра живых клеток в синий цвет. Связанные с хроматином красители дают возможность морфологически охарактеризовать изменения ядерного материала, присущие апоптозу: периферическое расположение хроматина, его конденсацию, пикноз и фрагментацию ядер, а также распад клеток на апоптотические тельца. Окрашивание проводили в ЗФР с красителями в конечной концентрации

10 мкмоль/л. Клетки отмывали центрифугированием и фиксировали 5% формалином в ЗФР. После отмывания клетки ресуспендировали и делали мазки. Исследования препаратов проводили на люминесцентном микроскопе Люмам И-1 (водно-иммерсионный объектив ×85) с использованием видеосистемы передачи изображения на компьютер. Определяли процент живых, апоптотических и некротических клеток при подсчете не менее 200 клеток. В крови животных определяли количество лейкоцитов и лейкограмму.

Перед статистическим анализом проводили проверку нормальности распределения количественных признаков в каждой группе с использованием критерия Колмогорова—Смирнова. При нормальном распределении данных осуществляли их однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с последующим сравнением между группами по тесту LSD Фишера. При отсутствии нормального распределения данные анализировали с помощью непараметрического аналога ANOVA — теста Краскела—Уоллиса с последующим сравнением между группами методом множественных сравнений Данна. Использовали программы Statistica 6 (StatSoft Inc) и GraphPad Prism 5.0 («GraphPad Software», San Diego, США). Данные представлены как M±SD (среднее значение ± стандартное отклонение). Различия при p<0,05 считали статистически достоверными.

Ранее мы показали [14, 18], что иммунизация мышей экстрактом аллогенных яичников приводила к повреждению ооцитов, нарушению их мейотического созревания, усилению апоптотической и некротической гибели фолликулярных клеток. Иммунизация вызывала реакции клеточного и гуморального иммунитета, интенсификацию гибели ИКК, а также сопровождалась воспалительными процессами на уровне организма [14, 18]. В настоящем исследовании мы применяли 4-ГК — ингибитор ПАРП-1 на фоне иммунного повреждения функции яичников у мышей.

Нарушения оогенеза, вызванные иммунизацией экстрактом аллогенных яичников, проявлялись снижением количества ооцитов, возобновляющих мейоз (рис. 1).

Полученные данные и их анализ свидетельствуют о том, что ядерный фермент ПАРП-1 задействован в патогенезе иммуноопосредованного повреждения яичников, а угнетение его активности может способствовать улучшению оогенеза. В литературе [9] есть отдельные данные о стимулирующем действии ингибиторов этого фермента на фолликулогенез. Ингибитор ПАРП 5-aminoisoquinolinone (5-AIQ) приводил к увеличению количества зрелых ооцитов и примордиальных фолликулов в яичниках мышей, а также количества эмбрионов, которые не имели признаков эмбриональной патологии. Важно, что при введении 5-AIQ старым мышам (более 9 мес) также увеличивалось количество овулировавших ооцитов.

Известно, что при иммунном повреждении усиливается гибель активированных клеток естественного и адаптивного иммунитета как в очаге воспаления, так и в иммунокомпетентных органах. Однако пути (некроз, апоптоз и др.) и механизмы клеточной гибели при иммуноопосредованном поражении яичников изучены мало, в частности, не исследована роль ПАРП-1. Изучение эффектов действия ингибиторов ПАРП на интенсивность и пути гибели клеток важно как для выявления роли этого фермента и некротической гибели в иммунном повреждении яичников, так и для оценки перспективы терапевтического применения ингибиторов ПАРП-1.

Определение жизнеспособности и гибели клеток, выделенных из тимуса, показало, что введение 4-ГК на фоне иммунизации экстрактом аллогенных яичников приводило к увеличению количества живых клеток (контроль — 91,9±1,6%, иммунизация — 87,9±2,8%; p<0,01 по отношению к контролю, иммунизация+4-ГК — 90,5±1,8%; p<0,05 по отношению к иммунизации). Улучшение жизнеспособности тимоцитов при ингибировании ПАРП-1 происходило за счет уменьшения их некротической гибели (в 1,9 раза в сравнении с иммунизацией), в то время как уровень апоптоза оставался неизменным (рис. 2, а).

Применение 4-ГК на фоне иммунизации мышей экстрактом аллогенных яичников также оказывало цитопротективное действие на клетки, выделенные из селезенки. Количество живых спленоцитов в контроле составляло 87,9±4,4%, в условиях иммунизации — 83,9±4,7%, при введении 4-ГК — 89,7±4,1% (p<0,05 по отношению к иммунизации). Применение блокатора ПАРП-1 значительно снижало некроз клеток селезенки, усиленный в результате иммунизации мышей.

В то же время изменений клеточной гибели по апоптотическому пути не было выявлено (см. рис. 2, б). Подобная закономерность наблюдалась и при исследовании клеток паховых лимфоузлов (см. рис. 2, в). Введение 4-ГК приводило к увеличению процента живых клеток, который в контроле составлял 87,4±4,3, при иммунизации — 81,2±3,6 (p<0,01 по отношению к контролю), при действии 4-ГК — 88,7±3,6 (p<0,01 по отношению к иммунизации). Улучшение жизнеспособности при введении ингибитора ПАРП-1 происходило в результате уменьшения количества клеток, гибнущих по некротическому пути (в 2,7 раза по сравнению с иммунизацией).

В настоящем исследовании не было выявлено существенных изменений апоптоза клеток лимфоузлов при действии 4-ГК.

Таким образом, ингибирование активности ПАРП-1 с помощью введения 4-ГК оказывало протективное действие на яичники, а также подобное по направленности и выраженности цитопротективное действие на клетки первичного (тимус) и вторичных (селезенка и лимфоузлы) иммунокомпетентных органов. Жизнеспособность иммуноцитов улучшалась за счет снижения их гибели по некротическому, а не апоптотическому пути. Ранее мы установили, что другой блокатор ПАРП — 3-АБА также способствовал улучшению функции яичников, увеличению количества живых клеток тимуса, лимфоузлов и селезенки и уменьшению их некротической гибели [14]. Эти результаты свидетельствуют, что фермент ПАРП-1 принимает участие в развитии иммунного повреждения яичников, в частности, через усиление некроза клеток. Снижение некроза при ингибировании ПАРП-1 способствовало устранению причин для развития иммунной реакции и воспаления в организме, что отразилось на показателях лейкограммы крови. Установлено снижение количества нейтрофильных гранулоцитов при действии 4-ГК на фоне иммунизации (контроль — 13,3±4,6%; при иммунизации — 24,5±5,0%; p<0,001 по отношению к контролю; при введении 4-ГК — 20,1,3±4,9%; p<0,01 по отношению к иммунизации).

Приведенные данные подтверждают положение о патогенетической роли ПАРП-1 в развитии воспаления и свидетельствуют об участии этого фермента в иммунном повреждении яичников. По современным представлениям, при генотоксическом стрессе с большим количеством разрывов ДНК происходит чрезмерная активация ПАРП-1, что приводит к исчерпанию НАД⁺ и АТФ, необходимых для поддержания функций клеток (в частности, мембранных насосов и ионного гомеостаза), а также для процесса апоптоза. В результате клетка гибнет по провоспалительному и иммуногенному некротическому пути [3, 4, 7, 15]. В работах последнего времени был выявлен ПАРП-1-зависимый тип гибели клеток, названный «партанатоз» (от par — poly-ADP-ribose и thanatos — олицетворение смерти в греческой мифологии) [11]. Эта клеточная гибель опосредуется АИФ, отличается от апоптоза, онкотического некроза и аутофагии и сопровождается, как правило, нарушением целостности плазматической мембраны и выходом содержимого клеток в ткани. Такой ПАРП-1-опосредованный механизм повреждения был показан при различных воспалительных процессах, ишемии миокарда, сахарном диабете, артрите [4, 6, 12, 15]. Мы предположили, что ПАРП-1 задействована в усилении клеточной гибели с нарушением целостности плазматической мембраны и при патологии яичников, поскольку при таких заболеваниях органов репродуктивной системы, как поликистоз яичников, эндометриоз, преэклампсия и привычный аборт, выявляется высокий уровень свободных радикалов и перекисного окисления липидов [19]. Это может приводить к сильному генотоксическому стрессу и избыточной активации ПАРП-1 [2, 4, 15, 16]. Мы установили, что при моделировании иммунной патологии яичников с помощью иммунизации экстрактом аллогенных яичников усиливалась некротическая гибель как фолликулярных, так и ИКК [14, 18], а ингибирование ПАРП-1 уменьшало интенсивность некроза, ослабляло воспаление и способствовало восстановлению функций яичника [14]. Таким образом, можно констатировать наличие ПАРП-1-опосредованного механизма иммунного повреждения яичников, связанного с усилением клеточной гибели по некротическому пути.

Для установления патогенетических механизмов аутоиммунных заболеваний важно исследовать гибель ИКК, поскольку баланс между активацией, выживанием и гибелью иммуноцитов напрямую влияет на интенсивность и характер иммунного ответа. Кроме того, путь клеточной гибели имеет определяющее значение для развития воспаления и иммунных реакций. Некротические клетки могут быть мощными иммуностимуляторами в результате выхода в ткани внутриклеточных молекул, определяемых как Damage-associated molecular pattern molecules (DAMPs). Комплекс этих компонентов (от таких малых, как АТФ, до макромолекул, таких как ДНК и РНК) способен стимулировать клетки естественного иммунитета через различные сенсорные системы, в том числе через Толл-подобные рецепторы [3, 20]. Это усиливает хемотаксис и инфильтрацию очага повреждения клетками естественного и адаптивного иммунитета, активирует иммунную систему, а также может вызвать формирование иммунного ответа по отношению к ранее спрятанным внутриклеточным антигенам [12, 20]. К таким последствиям может приводить некроз лейкоцитов, инфильтрирующих очаг повреждения. Апоптоз — более физиологический путь гибели клеток, он играет важную роль в процессах селекции лимфоцитов и элиминации их аутореактивных клонов, а также в механизмах ограничения иммунных реакций. При аутоиммунных процессах, в том числе в яичниках, гибель ИКК по апоптотическому пути может способствовать уменьшению иммунного воспаления и удалению аутореактивных лимфоцитов. С этой точки зрения, весьма важен установленный нами факт, что ингибирование ПАРП-1 с помощью мощного ингибитора 4-ГК способно снижать провоспалительную и иммуногенную некротическую гибель, не угнетая апоптоз, достаточный уровень которого необходим для регуляции и ограничения иммунного ответа. Это актуально при аутоиммунных процессах и открывает перспективу терапевтического применения селективных ингибиторов ПАРП-1 при заболеваниях с иммунным компонентом в патогенезе [3, 4, 7, 12].

Ингибиторы ПАРП могут оказывать свое протективное действие и через другие пути. При иммуновоспалительных процессах, в том числе и в органах женской репродуктивной системы, отмечается высокий уровень провоспалительных цитокинов [4, 13, 19]. Известно, что ПАРП усиливает NF-kB и АР-1-опосредованную активацию провоспалительных генов, а фармакологическое угнетение или отсутствие гена фермента ПАРП-1 приводило к уменьшению синтеза соответствующих молекул: интерлейкинов (ИЛ), в том числе ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-8, фактора некроза опухолей, гамма-интерферона, молекул адгезии и хемокинов, индуцибельных ферментов (NO-синтазы и циклооксигеназы) и др. Это было продемонстрировано на многих экспериментальных моделях воспалительных и аутоиммунных заболеваний [4, 6, 12, 13, 15]. Еще один механизм влияния ингибиторов ПАРП может быть связан с тем, что фермент, используя НАД⁺ как субстрат, включен в метаболический путь НАД⁺/НАДН, который вовлечен во многие важнейшие процессы, в том числе в кальциевый гомеостаз, митохондриальные функции, энергетический метаболизм, старение и гибель клеток [3, 6, 9].

Есть отдельные данные о позитивном эффекте ингибиторов ПАРП на яичники. Так, ингибирование ПАРП-1 приводило к увеличению количества фолликулов и количества зародышей у старых мышей [9]. Представленные здесь и полученные нами ранее результаты свидетельствуют о протективном действии ингибиторов ПАРП на функциональное состояние яичников, ооцитов и фолликулярных клеток [14]. Однако, принимая во внимание физиологическую роль ПАРП-1, ряд исследователей полагают, что ингибирование фермента может обусловить тенденцию к геномной нестабильности при хроническом повреждении ДНК. Следует также отметить, что фермент ПАРП важен для репродуктивной функции. Он вовлечен в гаметогенез, в том числе фолликуло- и оогенез, участвует в овуляции и имплантации эмбрионов, а ингибирование фермента может приводить к хромосомной нестабильности гамет [1, 2, 8—10]. Поэтому возможность и эффективность применения ингибиторов ПАРП с терапевтической целью при патологии органов репродукции должны быть тщательно исследованы. Если одним из ведущих звеньев патогенеза является порочный круг, приводящий к усилению воспалительных и аутоиммунных процессов, опосредованных ПАРП (сильный генотоксический стресс → гиперактивация ПАРП → экспрессия провоспалительных генов и некроз клеток → воспаление и аутоиммунные реакции → генотоксический стресс), то применение ингибиторов ПАРП может оказаться ключевым воздействием для прерывания этого деструктивного цикла [4, 7, 12, 15]. X. Luo и W. Kraus полагают, что перспективность терапии с помощью ингибиторов ПАРП обусловлена тем, что модулирование активности ПАРП может повернуть физиологический статус в том или ином направлении без необходимости блокировать фермент полностью [7]. Важно также, что активность ПАРП-1 зависит от метаболических кофакторов и ее можно эффективно ингибировать рядом малых молекул, таких как флавоноиды, витамин D и др. [3, 12, 15].

Перспективным для терапии воспалительных и аутоиммунных заболеваний представляется также подход, основанный на разработке и применении ингибиторов, мощных и более селективных по отношению к ПАРП-1, чем к ПАРП-2. Это связано с тем, что функции этих двух ферментов в клетке в основном дублируются, и в отсутствие ПАРП-1 его физиологическая роль осуществляется ПАРП-2 [6, 7, 12]. В то же время количество ПАРП-1 намного больше, чем всех остальных членов семейства ПАРП, его гиперактивация приводит к повреждению клеток и тканей, а ингибирование ПАРП-1 ослабляет патологические процессы в разных органах (такие как инфаркт миокарда, инсульт и септический шок), а также аутоиммунные заболевания (в том числе множественный склероз и ревматоидный артрит) [3, 4, 11—13, 15].

Высказывается мнение, что в недалеком будущем ингибиторы ПАРП будут применяться в клинике при острых воспалительных процессах, которые могут привести к летальному исходу. Частичное ингибирование ПАРП, в том числе и с помощью диетотерапии, будет более осторожным и безопасным методом профилактики и лечения различных заболеваний [3, 7, 12, 15].

В настоящем исследовании установлено участие ядерного фермента ПАРП-1 в нарушении оогенеза, опосредованное усилением некротической гибели клеток, а также выявлен существенный протективный эффект ингибитора ПАРП-1 4-ГК при экспериментальном иммунном повреждении яичников у мышей. И хотя функции ферментов семейства ПАРП активно исследуются и обсуждаются в широких научных кругах, многочисленные экспериментальные данные, в том числе и наши, свидетельствуют о позитивном эффекте ингибиторов фермента при воспалительных и дегенеративных процессах [4, 11, 13—15]. Проводится разработка и клинические испытания новых специфических ингибиторов ПАРП-1 [1, 5—7, 12, 15]. Мы показали, что 4-ГК является эффективным модулятором некроза и не влияет на апоптоз. Это важно с точки зрения применения ингибиторов ПАРП при аутоиммунных заболеваниях, когда необходима эффективная апоптотическая элиминация активированных аутоагрессивных клеток иммунной системы. Представленные результаты дают экспериментальное обоснование для исследования перспективности терапии с помощью ингибиторов ПАРП-1 при иммунной патологии яичников, а также при воспалении, в механизмах развития которого задействовано усиление некротической гибели клеток. Однако, учитывая важную физиологическую роль ПАРП-1, необходимы дальнейшие исследования отдаленных последствий ингибирования этого фермента на репродуктивную функцию.

Работа была выполнена при поддержке фонда Национальной академии наук Украины (0107U005336).