ВРТ широко используются в лечении бесплодия, исходом чего является рождение более 200 000 детей каждый год. Основной целью ВРТ является не только решить проблему бесплодия, но и привести к рождению здорового ребенка, нормального в своем развитии и не требующего медицинских вмешательств в дальнейшей жизни.

Зарождение жизни — очень чувствительный период, когда наш геном очень активно делится и подвержен влиянию окружающей среды, и несмотря на попытки ВРТ сымитировать естественные условия, все же этот вид зачатия и связанный с этими процедурами стресс (контролируемая гиперстимуляция овуляции, пункция фолликулов, денудация ооцитов, культивирование, механическое повреждение, перенос эмбрионов) приводят к легким изменениям в процессе зачатия и в первые дни жизни эмбриона.

В самом начале эры ВРТ весь научный мир был обеспокоен здоровьем детей, рожденных этим путем, однако спустя несколько лет стало очевидно, что поводов для беспокойства нет. И до сих пор, спустя некоторое время, регистры редких заболеваний, связанных с мутациями в некоторых импринтинг-генах, указывают на ВРТ в качестве одного из факторов риска развития этих заболеваний среди детей, рожденных при помощи ВРТ. К тому же этиология данных заболеваний в основном связана с нарушением метилирования импринтинг-генов, а не как в иных случаях с генетическими изменениями в структуре кодона. И это снова подняло вопрос о здоровье детей, рожденных с использованием ВРТ, и обратило внимание научного мира на ВРТ как поле для дальнейших исследований в области генетического и эпигенетического репрограммирования и возможных фенотипических изменений в жизни людей, рожденных при помощи ВРТ.

События раннего периода жизни (пренатальный и ранний постнатальный периоды) могут явиться причиной отдаленных изменений в жизни отдельного человека, повышая риск или приводя к развитию некоторых заболеваний, которые могли бы проявиться гораздо позже. Биология развития изучает процессы стойкого изменения генетических программ как результат приспособления к условиям окружающей среды и последующего изменения в экспрессии фенотипа [1, 2]. Эволюционные основы гибкости развития человека, когда условия окружающей среды могут репрограммировать фенотип, приводя, таким образом, к некоторым исходам для здоровья в более поздний период жизни [3]. Это впервые было описано в гипотезе Barker «Фетальные причины болезней взрослых», основанной на эпидемиологических исследованиях их регистра Великобритании, которые сравнивали массу тела и физические характеристики при рождении и последующее состояние здоровья тех же людей [4, 5]. Субоптимальные условия для развития плода, приводящие к рождению маловесных детей (такие как недостаточное питание матери) или диспропорционально больших детей, могут изменить физиологию и метаболизм, предрасполагая такой организм к развитию сердечно-сосудистых и метаболических нарушений в дальнейшем. Изучение голода в Голландии ясно показывает схожие результаты, добавляя, что изменения, вызванные нарушением питания плода, особенно в ранние периоды беременности, могут стойко влиять на развитие, а также передаваться в следующем поколении (эффект наследования). Изможденные голодом матери рожали маленьких детей, и их дочери со значимо большей частотой рожали маловесных детей, хотя их питание в течение беременности было регулярным [18]. Очевидно, что влияние факторов окружающей среды может сохраняться в поколениях, несмотря на недостаточное их воздействие.

Тщательно изучив эволюционную пластичность развития, [6] постулируют теорию «Эволюционные истоки здоровья и заболеваний», основанную на том факте, что развивающийся организм предиктивно реагирует и приспосабливается, создавая план жизни после рождения, зависящий от состояния in utero или состояния после зачатия, что таким образом дает ему все шансы на выживание.

Чем больше несоответствие между ожидаемой и реальной ситуацией, тем больше риск неблагоприятных исходов. Такой ответ является результатом уже установившихся изменений в экспрессии генов в течение жизни плода. Таким образом, субоптимальные условия фето-эмбрионального развития могут привести к отдаленным изменениям активности генома потомства вследствие метаболического репрограммирования путем эпигенетических модуляций как результата фето-эмбрионального предиктивного ответа.

Эмбриональный и фетальный периоды крайне чувствительны к воздействию факторов окружающей среды, и приобретенные изменения могут существовать в следующих поколениях, несмотря на недостаточное воздействие этих факторов в последующем. Возможное объяснение подобного исхода кроется в эпигенетической регуляции генома человека.

Эпигенетическая регуляция

Геном человека состоит приблизительно из 3000 генов. Мы наследуем по одному набору хромосом/генов от каждого родителя, что означает, что у нас есть две копии одного гена: от матери и от отца (исключение составляют только половые хромосомы). И это основа нашей программы определения последовательности кодонов в наших генах, так называемый генетический аппарат. Большинство генетических тестов изучают изменения последовательности ДНК, не обращая внимания на другие важные процессы, так называемое генетическое программное обеспечение — эпигенетические модификации или генное молчание или активация — механизмы, регулирующие способ и время действия наших генов.

После оплодотворения жизнь начинается с одной клетки, из которой образуется более 200 видов клеток с абсолютно разными функциями и синтезируемыми белками, хотя последовательность ДНК генома идентична в каждой клетке. Экспрессия генов находится под контролем эпигенетической регуляции, что, по существу, означает генетический контроль транскрипции генов, и это особый способ изменения активности ДНК и экспрессии генов. Этот механизм обеспечивает активацию или молчание определенных генов согласно ранее установленной эпигенетической наследственности, что приводит к хорошо организованному развитию организма и дифференциации клеток и тканей. Как только по мере дифференциации клетки эпигенетические маркеры устанавливаются, обеспечивая стабильную активность клеток, каждая клетка приобретает уникальные эпигенетические характеристики. Транскрипция возможна, если ген доступен транскрипторным факторам, и невозможна, если гены заблокированы эпигенетическим контролем, обеспеченным метилированием ДНК, изменениями гистонов, импринтингом генома и ремоделированием структуры хроматина [7]. Метилирование ДНК завершается у цитозина или у последовательности Ц-Г, где происходит сайленсинг генов. Экспрессия и метилирование генов происходит особым способом в различных тканях.

Обычно для большинства генов обе их копии активны, но для определенного числа генов, называемых импринтинг-генами, активна лишь одна копия в соответствии с ее происхождением (для некоторых импринтинг-генов активна материнская копия, а копия от отца молчит, для других — наоборот). Этот особенный эпигенетический контроль — импринтинг-генов — происходит раз в жизни и начинается в ранние периоды жизни эмбриона после удаления предыдущих импринтов и формирования новых гамет. Как только формируется специфический паттерн метилирования, импринтинг останавливается до следующего зачатия и развития новой жизни. Всего у человека около 80 импринтинг-генов, в основном отвечающих за фето-эмбриональное развитие, нейроповеденческое развитие и за факторы, подавляющие рост опухолей. Правильные импринты обеспечивают нормальное функционирование генов, если импринты утеряны, то будет активен вдвое больший объем генетического материала, или если активная копия будет метилирована, тогда ни одна из копий больше не будет активна, что нарушит нормальное функционирование.

Эпигенетическое репрограммирование происходит в течение всей жизни, однако определенные фазы развития, когда геном наиболее активен (например, оплодотворение, ранний эмбриональный период или гаметогенез), более чувствительны и подвержены неблагоприятному воздействию факторов окружающей среды. Нарушение эпигенетической программы может привести к развитию заболеваний у новорожденных, а также и в дальнейшем в жизни, и до сих пор наши знания об этих тонких изменениях ограничены.

Гаметогенез и ВРТ

После оплодотворения весь геном подвергается деметилированию за исключением импринтинг-генов, в которых потеря маркеров метилирования происходит на 12—13-й день после оплодотворения. Метилирование импринтинг-генов начинается в зависимости от того родителя, который даст начало метилированию, и таким образом происходит определение пола эмбриона (метилирование будет различным в ооците и в сперматозоиде и завершится в ооците прямо перед овуляцией в фазу роста, а в сперматозоиде значительно раньше). Таким образом, длинный период метилирования, начатый в эмбриональную фазу, закончится во взрослом возрасте в определенное время — явно значительно позже для ооцита, чем для сперматозоида [8]. Период, в течение которого возможно воздействие условий окружающей среды, длительный, и наиболее чувствительные фазы — внутриматочное развитие ооцита и преовуляторное созревание.

Чтобы получить больше ооцитов для оплодотворения в программах ВРТ, мы проводим пациенткам контролируемую гиперстимуляцию овуляции (КГЯ) при помощи гонадотропинов, изменяя естественный ход событий, когда в норме только один ооцит проходит созревание и происходит овуляция. Несомненно, это меняет условия среды в яичниках и влияет на активность генов ооцита. Незрелые ооциты также забираются и в дальнейшем подвергаются in vitro созреванию и оплодотворению.

Различные факторы могут повлиять на импринтинг в ооците во время его созревания и на эпигенетическую регуляцию генома. Группа под руководством G. Jones [9] изучает экспрессию генов в ооцитах, созревших in vivo и in vitro. В ооцитах, отобранных из циклов стимуляции, иначе происходит экспрессия генов в сравнении с естественно созревшими ооцитами в метафазе-II, а также у них иначе происходит развитие. В ооцитах, созревших in vitro, более 2000 генов экспрессируется в 2 раза сильнее и 162 гена экспрессируется в 10 раз сильнее в сравнении с ооцитами, созревшими in vivo, что говорит об экспрессии совершенно иных генов, а именно о других процессах активации. Знание этих различий очень важно, так как ооциты, взятые после стимуляции, и ооциты, созревшие in vivo, широко используются в ВРТ для лечения бесплодия.

Группа A. Sato [10] изучила влияние стимуляции овуляции на состояние метилирования определенных импринтинг-генов. Сравнивая ооциты, созревшие в естественных условиях и забранные во время лапароскопических вмешательств, с ооцитами из стимулированных циклов, они обнаружили, что стимуляция суперовуляции приводит к потере импринтинга определенных импринтинг-генов, например PEG1 (один из генов ооцита, в котором импринтинг происходит наименее активно), в 6 из 16 ооцитов (37%) или к усилению метилирования Н19-генов, регулирующих рост и развитие плода и эмбриона, в 30% ооцитов.

Пониженное питание матери в период созревания ооцита, перед овуляцией и зачатием может привести к развитию фенотипических заболеваний. На модели мышей A. Watkins и соавт. [15] изучали влияние низкопротеиновой диеты, начатой за 3 дня до овуляции, вплоть до развития ооцита, а с момента зачатия и до окончания беременности питание было с нормальным содержанием белка. При низком содержании белка в рационе во время зачатия рождалось потомство с нормальной массой тела и нормальные в развитии, однако среди них чаще встречались нервозный тип характера и сердечно-сосудистые изменения (повышение систолического артериального давления раньше развивалось у самцов, чем у самок, та же ситуация наблюдалась и с почками маленького размера). Это ясно показывает, как воздействие факторов окружающей среды даже перед оплодотворением может повлиять на постнатальное развитие и здоровье [11]. Ограничение белка в питании в течение позднего периода созревания ооцита вело к развитию фенотипических заболеваний, даже один из неблагоприятных факторов мог косвенным путем привести к стрессу, что говорит о влиянии на фенотип различных факторов, которым подвергается организм еще до зачатия.

Работа с гаметами и механические повреждения в ВРТ могут также спровоцировать эпигенетическое репрограммирование и развитие некоторых заболеваний у потомства [12].

И все же мы не должны забывать о том, что к помощи ВРТ обращаются пациенты со сниженной репродуктивной функцией, у которых уже могут быть генетически или эпигенетически измененные гаметы. Это усложняет дальнейшие исследования, имеющие целью разграничить эффекты стимуляции овуляции от ранее приобретенных аномалий в гаметах.

Развитие эмбриона и ВРТ

Потеря метилирования происходит в период между оплодотворением и формированием бластоцисты (метилирование сохраняется только в импринтинг-генах) и возобновляется в развивающемся эмбрионе, приводя к эпигенетическому репрограммированию и динамическим изменениям в растущем организме. Вероятно, наиболее уязвимый для воздействия факторов окружающей среды период — эмбриогенез, так как активность эпигенома очень высока и синтез ДНК происходит очень быстро, что необходимо для формирования различных тканей.

В ВРТ процесс оплодотворения происходит в лаборатории, ооциты и сперматозоиды подвергаются микроманипуляциям и различным механическим и химическим процедурам, затем эмбрионы выращивают в системе культур, чтобы в последующем перенести их обратно в матку при помощи катетеров.

В сравнении со спонтанно наступившей беременностью первые несколько дней жизни эмбриона значимо отличаются, несмотря на то что мы всячески стараемся воссоздать естественные условия его жизни.

Известно, что на дальнейшие рост и развитие плода можно повлиять в основном в периимплантационный период и во время имплантации путем изменения питания матери (недостаточное количество белков — аминокислот — и микроэлементов) или при субоптимальных условиях в лаборатории ВРТ. Многие журналы и исследования ВРТ говорят о внутриутробной задержке роста плода после использования ВРТ в сравнении со спонтанно наступившей беременностью. По меньшей мере два гена, в которых импринтинг происходит одновременно, играют роль в ЗРП: IGF II (активна копия отца, импринтинг происходит в материнской копии) и Н19 (активна копия от матери, отцовская — «молчит»). Они отвечают за баланс между снабжением плаценты и потребностями плода в питательных веществах [13]. Также пониженное питание матери в эмбриональный период может влиять на паттерн метилирования гормона роста GH/IGF, что приводит к изменению размера и функции плаценты. И это может быть основой взаимосвязи между репрограммированной эпигенетикой, развитием плода и восприимчивостью к хроническим метаболическим заболеваниям в дальнейшем во взрослом периоде [14].

Стандартные процедуры ВРТ, такие как культивирование эмбрионов, их перенос или манипуляции с гаметами и эмбрионами, также могут привести к изменению активности ферментативных регуляторов сердечно-сосудистых и метаболических процессов (АПФ и печеночная фосфоенолпируват-карбоксикиназа — ФЕПКК). Группа ученых под руководством A. Watkins [11] исследовали влияние ЭКО/ПЭ или только ПЭ на активность ферментативных регуляторов метаболизма и сердечно-сосудистой системы на модели мышей. У потомства, полученного при помощи ЭКО, они обнаружили повышенные уровни обоих ферментов (АПФ и ФЕПКК), и менее значимое повышение уровней ферментов наблюдалось при ПЭ, полученных in vivo (IV—ПЭ), другому животному в сравнении с животными, зачатыми в естественных условиях (ЕЗ). Изменения в систолическом артериальном давлении стали наблюдаться с 21-й недели жизни, показатели были наиболее высокими в группе ЭКО/ПЭ, постепенно снижаясь от группы IV—ПЭ к группе ЕЗ. Повышение активности печеночной ФЕПКК наблюдалось в группе ЭКО/ПЭ, однако после дополнительных расчетов значимое повышение отмечалось только среди самок группы ЭКО/ПЭ [15]. Аномальные условия жизни эмбриона, а именно культивирование систем эмбрионов и манипуляции в ВРТ, могут привести к развитию сердечно-сосудистых и метаболических изменений в дальнейшем в жизни.

Те же модели животных использовались при изучении отдаленных последствий культивирования эмбрионов для развития организма и формирования поведения (R. Fernandez-Gonzalez). Использовали две различные питательные среды, и позже рожденные животные проходили тесты, оценивающие их поведение и развитие. Что касается роста, массы и поведения, у взрослых мышей отмечались ожирение и изменения в поведении: повышенное беспокойство, замедленное нейромоторное развитие и измененная двигательная активность, особенно в группах, в которых культивирование эмбрионов проходило в субоптимальных условиях [16]. Возможным объяснением описанного являлось нарушение экспрессии мРНК импринтинг-генов. Высокое или низкое давление кислорода в системе сред может также пагубно сказаться на эмбрионах [17].

Окружающая среда

Вполне вероятно, что воздействие экологических факторов в ранний эмбриональный период может иметь отдаленные последствия, и было проведено огромное число исследований, освещающих проблему отдаленных последствий ВРТ для здоровья взрослого.

В современном мире мы живем, окруженные тысячами промышленных химикатов, и некоторые из них нарушают деятельность нашей эндокринной системы, что в итоге влияет на эпигенетику путем нарушения метилирования ДНК.

Токсины могут усилить эпигенетическое влияние, приводя к развитию повреждений в первой линии клеток, а также к стойкому репрограммированию в зародышевых клетках, что передастся следующему поколению клеток. Бисфенол А, химикаты, используемые в производстве пластмассы, могут повлиять на стволовые клетки эмбриона крыс, повышая частоту ожирения в дальнейшем вне зависимости от пола и ухудшая сперматогенез в следующих трех поколениях [27]. Назначение фолиевой кислоты может предотвратить развитие этих эффектов.

Многие химикаты, такие как ксенобиотики и оловоорганические вещества, принимаемые вместе с едой пренатально, могут привести к развитию ожирения, так как они обладают эстрогенной активностью. Например, трибутилин, используемый как фунгицид в выращивании зерновых и картофеля, является веществом с токсичным эффектом для эндокринной системы. Накопление в определенных областях мозга амигдалина может повысить риск развития шизофрении, аутизма и болезни Альцгеймера.

Недостаток фолиевой кислоты может привести к снижению метилирования, а избыточное ее потребление может привести к противоположному эффекту — усилению метилирования генома, что поднимает вопрос о том, в каких количествах и кому следует назначать фолиевую кислоту во время беременности.

Эволюционная гибкость генома человека и пожизненная активность эпигенетического репрограммирования в целях приспособления к условиям окружающей среды, так же как и продолжительность жизни, создают трудности для изучения возможных влияний на наш эпигеном. Динамическое состояние генома в периконцепционный и перинатальный периоды делают его крайне подверженным неблагоприятным воздействиям, которые могут изменить эпигеном, что повлияет на развитие организма и повысит риск развития заболеваний во взрослом возрасте. При этом возможна передача эпигенетических изменений следующим поколениям, несмотря на отсутствие воздействия факторов окружающей среды, которые обычно приводят к таким последствиям. Понимая, что эти эффекты не краткосрочны, мы должны придумать новые методы профилактики, диагностики и лечения в этот уязвимый период.