Исследовали влияние ингибитора активации ядерного фактора NF-κB пирролидина дитиокарбамата (ПДТК) на мейотическое созревание ооцитов мышей, выживаемость клеток кумулюсного окружения ооцитов (ККОО) и их гибель по апоптотическому и некротическому пути, а также активатора NF-κB линолевой кислоты (ЛК) на изменения электрокинетических свойств ядер и количества гранул гетерохроматина, расположенного около ядерной мембраны в ядрах фолликулярных (кумулюсных и гранулярных) клеток из малых, средних и больших фолликулов мышей в условиях экспериментальной митохондриальной дисфункции (вызываемой окислительным стрессом: гипоксантин/ксантиноксидаза).
За 20 лет, начиная с момента открытия, исследование транскрипционного ядерного фактора kappa B (NF-κB) показало удивительное разнообразие его функций. NF-κB белки являются регуляторами иммунитета, воспаления, стресса, пролиферативных и aпоптотических ответов клетки на большое количество различных стимулов. NF-κB комплексы найдены во всех типах клеток, указывая на то, что разнообразие эффектов, в которых NF-κB может стать индуктором, огромно [1—6]. Выяснение влияния активации и угнетения NF-κB на систему ооцит и клетки его кумулюсного окружения расширит наше понимание его роли в созревании ооцита и в развитии расстройств, ведущих к бесплодию у женщин, а также то, как воздействовать на клетки-мишени с использованием клинических NF-κB-терапий в будущем.
Цель настоящей работы — исследование влияния ингибитора активации ядерного фактора NF-κB пирролидина дитиокарбамата (ПДTК) на мейотическое созревание ооцитов мышей и выживаемость клеток кумулюсного окружения ооцитов (ККОО) и их гибель по апоптотическому и некротическому пути, а также оценка влияния линолевой кислоты — ЛК (активатора NF-κB) — на изменения электрокинетических свойств ядер и количества гранул гетерохроматина, расположенного около ядерной мембраны в ядрах фолликулярных (кумулюсных и гранулярных) клеток из малых, средних и больших фолликулов мышей в условиях экспериментальной митохондриальной дисфункции (вызываемой окислительным стрессом: гипоксантин/ксантиноксидаза).
Материал и методы
Исследования проводили на самках мышей линии СВА 6—8-недельного возраста (масса 18—20 г). Яичники выделяли на стадии диэструса. Умерщвляли мышей методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом.
Для первой серии экспериментов из яичников неферментативно выделяли ККОО (без определения размера их фолликула), которые культивировали при 37 °С в течение 20 ч. После 4 ч культивирования ооциты отделяли от ККОО и подсчитывали количество ооцитов на стадии метафазы І — растворение зародышевого пузырька, а после 20 ч — на стадии метафазы ІІ — формирование первого полярного тельца.
Для оценки живых, апоптотических и некротических ККОО использовали метод прижизненной двойной окраски флюоресцентными красителями: хехст 33422 и пропидиума йодид. Морфологические исследования проводили с помощью люминесцентного микроскопа МЛ-2. Определяли процент живых, апоптотических и некротических клеток при подсчете не менее чем 600 клеток.
Для второй серии экспериментов из яичников неферментативно выделяли ККОО из фолликулов следующих размеров: малые — 144—151 мкм, средние — 251—265 мкм, большие — 329—337 мкм. Из фолликулов каждой группы выделяли ККОО и культивировали их в течение 20 ч. Для оценки их морфологических особенностей использовали метод прижизненной двойной окраски флюоресцентными красителями: хехст 33422 и пропидиума йодид. Определяли процент живых, апоптотических и некротических клеток при подсчете не менее чем 600 клеток.
Биоэлектрические свойства клеточных ядер исследовали с использованием метода внутриклеточного микроэлектрофореза [7]. Определяли количество клеток с отрицательно, положительно и нейтрально заряженными ядрами при подсчете 100 клеток и при повторе от 4 до 12 раз для каждой группы фолликулов. Основными показателями служили процент электроотрицательных ядер (ЭОЯ) и процент электроположительных ядер (ЭПЯ). ЭОЯ ККОО имеют деконденсированный хроматин во всех группах фолликулов; нейтральным ядрам соответствуют такие морфологические особенности: конденсированный хроматин, конденсированные ядра и фрагментированные ядра, поврежденная мембрана; ЭПЯ ККОО — сильно конденсированный хроматин, фрагментированные ядра, целая мембрана, апоптотические тельца.
Экспериментальный окислительный стресс ККОО (серия 2) вызывали системой гипоксантин (1 ммоль)/ксантиноксидаза (1 ед/мл).
Исследовали влияние: ПДТК — ингибитора активации ядерного фактора NF-κB в концентрациях 0,1 и 1 мкмоль; ЛК — активатора ядерного фактора NF-κB — 5 ммоль. ЛК активизирует NF-κB и вызывает NF-κB-зависимую транскрипцию в культуре эндотелиальных клеток [8]. ПДТК ингибирует активацию ядерного фактора NF-κB, предотвращая деградацию ингибиторной субъединицы IκB-α [9]. Используемые концентрации были подобраны по данным литературы и испытаны на мышах линии СВА. В каждой серии экспериментов присутствовали интактные контрольные клетки. Все реактивы производства фирмы «Sigma» (США).
Для определения вероятности различий между средними группами данных использовали t-критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Данные о влиянии ПДТК на ооциты мышей представлены на рис. 1.
При действии 1 мкмоль ПДТК наблюдалось угнетение разрушения зародышевого пузырька (69,37±2,15% против 89,26±3,01% в контроле) и формирования первого полярного тельца (12,26±3,32% против 65,81±5,11% в контроле). Использование меньшей концентрации ингибитора 0,1 мкмоль не влияло достоверно на процесс возобновления мейоза (хотя тенденция к угнетению наблюдалась: 82,25±0,5% против 89,26±3,01% в контроле), однако значительно угнетало формирование первого полярного тельца (24,77±1,86% по сравнению с 65,81±5,11% в контроле).
Таким образом, ингибитор активации NF-κB ПДТК угнетает мейотическое созревание ооцитов мышей in vitro.
Показано [10], что невысокий уровень NF-κB/p65-связывающей активности отмечен в незрелых ооцитах, но не проявлялся совсем в ооцитах, которые уже достигли стадии метафазы ІІ. Нами впервые показано, что ингибитор активации NF-κB ПДТК угнетает мейотическое созревание ооцитов. Полученные нами результаты согласуются с данными [10], и мы полагаем, что IκBα/NF-κB цикл, возможно, является механизмом, строго зависящим от стадии развития ооцита. Также возможно предположить, что NF-κB регулирует экспрессию генов, которые вовлечены в регуляцию развития ооцита от стадии зародышевого пузырька до стадии формирования первого полярного тельца.
Данные о влиянии ПДТК на количество живых, апоптотических и некротических ККОО мышей представлены на рис. 2.
При действии 0,1 и 1 мкмоль ПДТК наблюдалось снижение количества живых ККОО (соответственно 25,36±0,65 и 10,06 ±0,39% против 62,94±1,37% в контроле; n=8) в большей степени за счет увеличения числа клеток, погибших путем апоптоза (68,82±0,71 и 82,19±0,43% по сравнению с 32,56±1,53% в контроле; n=8). При этом процент некроза увеличивался незначительно (соответственно 5,82±0,33 и 7,75± 0,27% против 4,69±0,27% в контроле; n=8).
Таким образом, ингибитор активации ядерного фактора NF-κB ПДТК вызывал снижение количества живых ККОО за счет увеличения числа клеток, погибших путем апоптоза.
Из литературы [11, 12] известно, что NF-κB является важным регулятором выживания, пролиферации и апоптоза, при этом в зависимости от типа клеток, их функционального состояния и наличия других сигналов активация данного транскрипционного фактора может способствовать как выживанию, так и гибели клеток. Нами показано, что ингибитор активации ядерного фактора NF-κB ПДТК вызывает снижение количества живых ККОО за счет увеличения числа клеток, погибших путем апоптоза. Полагаем, что в норме NF-κB защищает кумулюсные клетки от апоптотической гибели, таким образом являясь регулятором их выживания. Учитывая, что ооцит развивается в тесной взаимосвязи с клетками кумулюсного окружения, можно предположить, что нарушение активации NF-κB в кумулюсных клетках может негативно отражаться на функциональном состоянии ооцитов, их мейотическом созревании. Полученные данные могут свидетельствовать также о том, что NF-κB является звеном сигнального пути, который отвечает за выживание ККОО, защищая их от апоптотической гибели.
В условиях экспериментального окислительного стресса, вызываемого системой гипоксантин (1 ммоль)/ксантиноксидаза (1 ед/мл), происходит увеличение (р<0,001; n=8) количества апоптотических ККОО во всех экспериментальных группах; ЛК (5 ммоль) не уменьшает (р>0,001; n=9) количество апоптотических ККОО из малых фолликулов (табл. 1).
В условиях экспериментального окислительного стресса, вызываемого системой гипоксантин (1 ммоль)/ксантиноксидаза (1 ед/мл), происходит уменьшение количества ЭОЯ ККОО в ККОО из малых (р<0,001; n=9) и средних (р<0,05; n=7) фолликулов яичников мышей. В условиях экспериментальной митохондриальной дисфункции (вызываемой окислительным стрессом: гипоксантин/ксантиноксидаза) ЛК (5 ммоль) не увеличивает (р>0,001; n=12) количество ЭОЯ ККОО из малых фолликулов (табл. 2).
Нами впервые установлено, что ЛК (и предположительно жирные кислоты) вызывает дисфункцию ККОО, и что клеточные изменения (электроотрицательность и морфологические признаки апоптоза ядер ККОО) — критически ранние события, характерные для окислительного стресса.
Наши данные не свидетельствуют об активации экспрессии генов под действием ЛК в условиях экспериментального окислительного стресса. Мы полагаем, что активация NF-κB не принимает участия в геномной защите ККОО.
Заключение
Пирролидин дитиокарбамата (ингибитор активации ядерного фактора NF-κB) угнетает мейотическое созревание ооцитов и снижает количество живых ККОО за счет увеличения числа клеток, погибших путем апоптоза; ЛК, активатор ядерного фактора NF-κB, вызывает дисфункцию ККОО и клеточные изменения (такие как электроотрицательность и морфологические признаки апоптоза ядер ККОО) — критически ранние события, характерные для окислительного стресса.
Работа поддержана грантом «Физиолого-биохимические и молекулярно-генетические основы функционирования живых систем и разработка принципов руководства ними». Постановление Президиума НАН Украины №16 от 23.01.02.