Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Копылова И.В.

ФГБУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации

Сысоева В.Ю.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Глыбина Т.М.

Измайловская детская городская клиническая больница Департамента здравоохранения Москвы

Карева М.А.

Институт детской эндокринологии Эндокринологического научного центра, Москва

Экспрессия эстрогеновых и андрогеновых рецепторов в тканях наружных половых органов у девочек с врожденной дисфункцией коры надпочечников

Авторы:

Копылова И.В., Сысоева В.Ю., Глыбина Т.М., Карева М.А.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2014;60(6): 14‑20

Просмотров: 594

Загрузок: 5

Как цитировать:

Копылова И.В., Сысоева В.Ю., Глыбина Т.М., Карева М.А. Экспрессия эстрогеновых и андрогеновых рецепторов в тканях наружных половых органов у девочек с врожденной дисфункцией коры надпочечников. Проблемы эндокринологии. 2014;60(6):14‑20.
Kopylova IV, Sysoeva VIu, Glybina TM, Kareva MA. Expression of estrogen and androgen receptors in tissues of external genitalia of girls with congenital adrenal hyperplasia. Problemy Endokrinologii. 2014;60(6):14‑20. (In Russ.).
https://doi.org/10.14341/probl201460614-20

?>

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН, адреногенитальный синдром - АГС) - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное патологией ферментов или транспортных белков, участвующих в синтезе кортизола. Самый распространенный вариант ВДКН, связанный с недостаточностью 21-гидроксилазы и встречающийся в классическом варианте с частотой приблизительно 1:10 000-1:18 000 новорожденных, приводит у девочек к различной степени вирилизации наружных половых органов (НПО) при рождении вследствие пренатального избытка надпочечниковых андрогенов [1, 2]. Внутренние половые органы (матка, фаллопиевы трубы, проксимальная часть влагалища) у таких девочек имеют правильное строение, тогда как маскулинизация наружных гениталий может варьировать от незначительной гипертрофии клитора до полностью мужского строения НПО (по шкале Прадера 2-5). Феминизирующую пластику гениталий проводят в 1 или 2 этапа в зависимости от степени вирилизации гениталий [1, 3-6]. Первый этап заключается в резекции клитора и рассечении урогенитального синуса, второй (интроитопластика) - в создании входа во влагалище (интроитуса). Достаточно большой процент пациенток после интроитопластики (несмотря на хороший косметический результат) имеют узкий для возможности полового акта диаметр влагалища, что связано с рубцеванием постоперационной поверхности, приводящим к стенозу. Это осложнение встречается чаще ( в 36-100% случаев) после одноэтапной пластики в раннем детском возрасте [3, 7-9]. Неудовлетворительные результаты интроитопластики требуют повторных оперативных вмешательств или многократных бужирований [9, 10]. В РФ феминизирующую пластику проводят в два этапа: I - в раннем детском возрасте, II - в пубертатном, когда завершается формирование влагалища и достигается оптимальная эстрогенизация его слизистой оболочки (обычно через 1-2 года после начала менструаций). Обоснованием для интроитопластики именно в этот период служат исследования, доказывающие влияние эстрогенов на процесс эпителизации тканей. Известно, что под воздействием эстрогенов происходит стимуляция моторики кератиноцитов, усиливается ангиогенез, происходит вазодилятация, предотвращается избыточное образование коллагеновой ткани [11-13]. У пациенток с ВДКН гипоэстрогения обусловлена снижением продукции эстрогенов яичниками. Это происходит вследствие подавления секреции гонадотропинов избытком надпочечниковых андрогенов. Большинство авторов связывают возникновение постоперационного стеноза интроитуса со снижением эстрогеновой насыщенности вагинальной слизистой вследствие декомпенсации заболевания в период пубертата. Однако данных, подтверждающих роль одной только компенсации в достижении оптимальной эстрогенизации НПО, в литературе до сих пор нет. Остается нерешенным вопрос: возможно ли снижение местной чувствительности наружных гениталий к эстрогенам вследствие избыточной продукции андрогенов еще в пренатальном периоде? В литературе отсутствуют данные о влиянии внутриутробной гиперандрогении на распределение и экспрессию эстрогеновых и андрогеновых рецепторов в вульве и влагалище, первоначальное количественное изменение которых могло бы послужить одним из объяснений снижения эстрогенизации тканей гениталий.

Кожа малых половых губ (МПГ) является производным эктодермы, поэтому, как и кожа других анатомических участков, состоит из эпидермиса, представляющего собой многослойный плоский ороговевающий эпителий, и дермы с волосяными фолликулами, потовыми и сальными железами. Толщина кожи и степень ороговения уменьшается по направлению к передней части клитора и при переходе от наружной поверхности МПГ к внутренней. Поверхностный слой слизистой оболочки преддверия влагалища (интроитуса) и влагалища представлен плоским неороговевающим эпителием, чувствительным к циклическим изменениям уровня стероидных гормонов, продуцируемых яичниками [14]. Эпителий стенки влагалища состоит из трех слоев (базально-парабазального (Б-ПБ), промежуточного (ПР) и поверхностного с кариопикнотичными клетками), отделенных от субэпителиальной ткани (стромы) базальной мембраной. В норме в тканях НПО экспрессируются как АР, так и ЭР, относящиеся к семейству ядерных [15-17]. АР определяются преимущественно в эпидермальных кератиноцитах, сальных и потовых железах, волосяных фолликулах и фибробластах кожи МПГ, а также в эпителии и фибробластах стромы влагалища. ЭР преобладают в базальных и парабазальных клетках вагинального эпителия, что объясняет стимулирующее воздействие эстрогенов на пролиферацию и дифференцировку клеток вагинального эпителия. ЭР присутствуют также в фибробластах и гладких мышцах влагалища, в эпидермисе кожи МПГ. Число ЭР снижается, а АР возрастает по направлению от шейки матки к коже надлобковой области и от внутренней поверхности малых половых губ к наружной [15]. Действие двух изоформ эстрогеновых рецепторов (ЭРα и ЭРβ) неодинаково в различных тканях [18]. Изменения их экспрессии в одной и той же ткани при различных физиологических состояниях свидетельствуют о различной ответной реакции ткани-мишени на воздействие эстрогенов.

В литературе отсутствуют данные о распределении и экспрессии этих рецепторов в тканях наружных гениталий у здоровых девочек допубертатного и пубертатного возрастов, что связано с невозможностью получения у них полноценного биоматериала в силу морально-этических аспектов. Подобные исследования проводились в основном у женщин пре- и менопаузального возраста, пациенток на фоне заместительной терапии эстрогенами или андрогенами и на животных [15-17, 19, 20].

Цель настоящей работы - определение чувствительности наружных половых органов девочек с ВДКН к эстрогенам посредством изучения количества и распределения ЭР и АР в зависимости от формы заболевания, степени вирилизации наружных гениталий при рождении и уровня андрогенов.

Материал и методы

В исследование были включены девочки с классическими формами ВДКН [n=21, сольтеряющая форма (СТ) - 7 девочек, простая вирильная форма (ПВ) - 14], которым было показано проведение I или II этапов феминизирующей пластики НПО. Все пациентки регулярно наблюдались в детском отделении ФГБУ ЭНЦ. В зависимости от этапа пластики и материала для исследования девочки были разделены на две группы (таблица).

У 13 пациенток допубертатного возраста [медиана возраста 2,4 года (2; 5 лет), СТ - 11, ПВ - 2, степень вирилизации наружных гениталий при рождении по шкале Прадера 3 (3; 4)] были проведены резекция клитора и рассечение урогенитального синуса. Интроитопластика проведена у 8 девочек пубертатного возраста [медиана возраста 16,75 года (15,2; 17,6 года), СТ - 3, ПВ - 5, степень вирилизации по Прадеру 3 (3; 4)].

Перед оперативным лечением у всех пациенток определяли антропометрические показатели, оценивали степень вирилизации наружных гениталий и стадию полового созревания по Таннеру (1968) и проводили гормональное обследование с определением уровней тестостерона, 17-гидроксипрогестерона (17-ОПГ), активности ренина плазмы. Содержание общего тестостерона в сыворотке определяли методом усиленной хемилюминесценции с помощью автоматического иммунохимического анализатора Vitros 3600 («Ortho Clinical Diagnoxtics», «Johnson & Johnson»). Для оценки концентрации 17-ОПГ в сыворотке использовали радиоиммунный анализ (Immunotech, ISO 9001-13485). Все девочки, вошедшие в исследование, находились в состоянии компенсации ВДКН.

Феминизирующая пластика НПО проводилась в отделении гинекологии ИДГКБ №3. Для определения ЭР и АР был использован операционный материал, полученный в ходе проведения I и II этапов пластики. В первом случае образцы ткани были представлены тканью малых половых губ, во втором - тканями дистальной части влагалища вблизи преддверия (интроитуса). Иммуногистохимическое исследование проведено на базе Центра коллективного пользования факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова. Операционный материал фиксировался в 4% растворе формалина в течение 24-72 ч и затем помещался в парафин. Исследование локализации АР, ЭРα и ЭРβ проведено на парафиновых срезах толщиной 3 мкм по стандартной иммуногистохимической методике на иммуностейнере Autostainer Link 48 («Dako», США) с использованием коммерческих мышиных моноклональных антител против ЭРα [(клон 6F11), разведение 1:80]; ЭРβ [(клон EMR02), разведение 1:50]; АР (клон AR27), разведение 1:100) («Novocastra») с предварительной демаскировкой антигенов в соответствии с протоколом производителя. Время инкубации с первичными антителами составило 1 ч для эстрогеновых и 2 ч для андрогеновых рецепторов при комнатной температуре. Проявление реакции осуществлялось системой визуализации Peroxidase Detection System («Novocastra», Великобритания). В качестве негативного контроля использованы ткани миндалин, в качестве положительного - ткани эндометрия (для ЭРα), кожи (для ЭРβ), карциномы простаты (для АР), рекомендованные в описании к коммерческим антителам. Для серо-негативного контроля был использован мышиный IgG (FLEX Negative Control Mouse Cocktail; «Dako»). Морфометрический анализ проведен на микроскопе Zeiss Axioscop 40, оснащенном камерой AxioCam MRc5 Zeiss. Процент окрашенных клеток оценивали в 6-10 полях зрения при увеличении х40 для каждого маркера в образце. В ткани МПГ, помимо общего уровня рецепторов, оценивалось количество иммунореактивных клеток отдельно в эпидермальном и дермальном слоях, а в слизистой влагалища - отдельно в Б-ПБ и ПР слоях эпителия и в строме.

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы Statistica («StatSoft Inc.», США, версия 8.0). Данные представлены в виде медианы, с указанием 25-75 процентилей. Оценка достоверности различий между группами проводилась с помощью теста Манна-Уитни. Связь двух признаков анализировалась с помощью ранговой корреляции по Спирмену. Критический уровень значимости различий принимался равным 0,05.

Результаты и обсуждение

В МПГ ЭРα были локализованы в ядрах фибробластов и гладкомышечных клеток дермы, ядрах клеток Б-ПБ слоя эпидермиса (рис. 1-3 и далее см. на цв. вклейке).

Рисунок 1. Ядерное окрашивание ЭРα в клетках дермального слоя кожи внутренней поверхности малых половых губ. х200.
Рисунок 2. Ядерное окрашивание ЭРα в клетках базального слоя эпидермиса, наружная поверхность малых половых губ. х200.
Рисунок 3. Окрашивание ЭРα в гладкомышечных клетках дермы малых половых губ. х400.
Общая доля клеток, экспрессирующих рецептор, была невысокой и составила 16,8% (12,7; 22,8%), что согласуется с данными о распределении этих рецепторов в коже МПГ здоровых женщин [15]. Этот факт позволил авторам констатировать неэффективность трансвульварного использования кремов с эстрогенами. На внутренней поверхности МПГ, прилежащей к клитору, иммунореактивность ЭРα в дерме была выше, чем в наружной поверхности. Ядерное окрашивание клеток Б-ПБ слоя эпидермиса отмечалось преимущественно у наружного края МПГ. Статистически значимой разницы в общем количестве ЭРα-иммунопозитивных клеток в эпидермисе [14,7% (11,8; 25,3%)] и дерме [18,2% (16,3; 31,85)] выявлено не было (р>0,05) (рис. 4).
Рисунок 4. Распределение ЭРα-, ЭРβ- и АР-позитивных клеток в коже малых половых губ (n=13).

Интенсивное ядерное окрашивание ЭРβ отмечалось в клетках всех слоев эпидермиса, фибробластах дермы, в эндотелии сосудов, эпителиальных клетках протоков апокринных желез и гладкомышечных клетках кожи малых половых губ (рис. 5, 6).

Рисунок 5. Интенсивное ядерное окрашивание ЭРβ в малых половых губах. х200.
Рисунок 6. Экспрессия ЭРβ в ядрах гладкомышечных клеток (черная стрелка) и в клетках эндотелия сосудов (красная стрелка) дермы малых половых губ. х200.
Число ЭРβ-позитивных клеток в эпидермисе было статистически значимо выше, чем в дермальном слое [100% (98; 100%) против 73,1% (63,9; 83,9%); р<0,01] (см. рис. 4).

Интенсивное окрашивание ЭРβ было выявлено также в вульве здоровых женщин репродуктивного возраста [20]. Биологическая роль ЭРβ в этих тканях недостаточно изучена. Известно, что при некоторых онкологических заболеваниях в случае коэкспрессии ЭРα и ЭРβ, ЭРβ оказывает ингибирующее действие на ЭРα-опосредованную экспрессию генов и регулирует ответ ткани-мишени на воздействие эстрогенов [21, 22]. Нами не выявлено корреляции между количеством ЭРα и ЭРβ в коже малых половых губ девочек с ВДКН (rs=0,64; р>0,05).

АР в коже МПГ девочек с ВДКН экспрессировались преимущественно в ядрах клеток эпидермиса, прилежащих к базальному слою, в эпителиальных клетках протоков желез. В дерме отмечалось незначительное ядерное окрашивание АР (рис. 7, 8).

Рисунок 7. Экспрессия АР в эпидермисе малых половых губ. х400.
Рисунок 8. Слабая иммунореактивность АР в дермальном слое малых половых губ. х400.
Количество АР-иммунопозитивных клеток составило 11,1% (8,1; 17,6%). Иммунореактивность АР на внутренней поверхности МПГ в эпидермисе была достоверно ниже, чем на наружной. Экспрессия АР в эпидермисе была статистически значимо выше, чем в дерме [15,95% (10,2; 18,7%) против 1,8% (1,5; 3%); р<0,01].

Не было выявлено статистически значимой зависимости между количеством ЭР и АР в МПГ и степенью вирилизации наружных гениталий, а также между числом клеток, экспрессирующих ЭР и АР, и уровнем андрогенов в крови (тестостерон, 17-ОПГ). Количество данных рецепторов не различалось при различных формах ВДКН как у пациенток моложе 4 лет (n=10), так и у девочек старше 6 лет с начавшимся адренархе (n=3).

Во влагалище ЭРЭРα были локализованы в ядрах клеток Б-ПБ слоя вдоль базальной мембраны и в ПР слое эпителия, а также в фибробластах стромы (рис. 9, 10).

Рисунок 9. Ядерное окрашивание ЭРα в вагинальном эпителии. х200.
Рисунок 10. Ядерное окрашивание ЭРα в строме влагалища. х200.
Количество иммунопозитивных клеток составило 49,5% (41,8; 58,7%). Иммунореактивность в эпителии была статистически значимо выше, чем в строме [61,3% (55,7; 65,7%) против 23,7% (14,3; 43,9%); р<0,01] (рис. 11).
Рисунок 11. Распределение ЭРα-, ЭРβ- и АР-позитивных клеток во влагалище (n=8).
В пределах эпителия доля окрашенных ЭРα клеток была выше в Б-ПБ слое по сравнению с ПР [73,8% (60,8; 87,2%) против 52,1% (49,6; 54%); р<0,05] (рис. 12).
Рисунок 12. Распределение ЭРα-, ЭРβ- и АР-позитивных клеток в эпителии влагалища.
В поверхностном слое эпителия клеток, экпрессирующих ЭРα, не выявлено. Наличие ЭР-позитивных клеток преимущественно в Б-ПБ слое отражает роль эстрогенов в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток в эпителии влагалища.

Данные литературы о наличии и распределении ЭРβ в слизистой влагалища противоречивы. Одни авторы не находили экспрессии ЭРβ в тканях влагалища [23], другие подтверждали их наличие [17, 20]. Исследования на нокаутных по ЭР мышах показали, что ЭРα является основным рецептором, опосредующим вагинальный ответ на 17β-эстрадиол [24]. У мышей, нокаутных по ЭРα, при гистологическом анализе выявлено полное отсутствие эстрогенизации влагалища под воздействием экзогенного эстрадиола [25, 26]. С другой стороны, слизистая оболочка влагалища у нокаутных по ЭРβ мышей претерпевает нормальные циклические изменения, связанные с яичниковым стероидогенезом, указывая на то, что это ЭРβ-опосредованный процесс [25]. По нашим данным, доля клеток, экспрессирующих ЭРα в ткани влагалища, составила 48,1% (34,5; 67,7%).

ЭРβ были выявлены в клетках Б-ПБ, ПР и в единичных случаях поверхностного слоя эпителия, а также в фибробластах стромы (рис. 13, 14).

Рисунок 13. Экспрессия ЭРβ в клетках эпидермиса слизистой влагалища. х400.
Рисунок 14. Экспрессия ЭРβ в клетках дермы слизистой влагалища. х400.
Иммунореактивность в эпителии не отличалась от таковой в строме [55,7% (40,9; 80,3%) против 45,1% (32,7; 62,7%), р>0,05]. Число клеток, позитивных по ЭРβ в Б-ПБ слое было статистически значимо выше, чем в ПР слое эпителия.

Доля клеток, экспрессирующих АР составила 6,6% (3,6; 16,5%), что существенно ниже по сравнению с другими исследованными рецепторами. АР были локализованы в базальном слое эпителия вдоль базальной мембраны и в единичных клетках стромы (рис. 15, 16).

Рисунок 15. Экспрессия АР (коричневая окраска) в клетках базального слоя эпителия влагалища. х400.
Рисунок 16. Единичные АР-позитивные клетки стромы стенки влагалища. х400.
Число АР-позитивных клеток в эпителии статистически не отличалось от такового в строме [5,4% (2; 18,1%) против 8,4% (2,3; 18,8%), р>0,05].

Полученные данные о наличии и распределении рецепторов стероидных гормонов в эпителии влагалища сопоставимы с результатами, полученными при исследовании этой ткани у здоровых женщин репродуктивного возраста [15, 20].

Среди пациенток пубертатного возраста, нуждающихся в проведении II этапа феминизирующей пластики, были 2 девочки, у которых интроитопластика проводилась повторно. В течение 1 мес перед оперативным лечением они получали местную терапию эстрогенами (крем Овестин). Еще одна пациентка в течение 4 мес перед операцией получала комбинированные пероральные контрацептивы (Новинет) по поводу нарушений менструального цикла. При иммуногистохимическом исследовании количество клеток, экспрессирующих ЭРα, у этих пациенток было статистически значимо ниже, чем у девочек, не получавших предоперационно эстрогенотерапию, у которых интроитопластика проводилась впервые (р=0,045) (рис. 17, 18).

Рисунок 17. Количество ЭРα позитивных клеток во влагалище у пациенток с первичной (перв) и повторной (повтор) интроитопластикой.
Рисунок 18. Количество ЭРα позитивных клеток во влагалище у пациенток без терапии эстрогенами (-), на фоне местной эстрогенотерапией Овестином (+О) или Новинета (+КОК).

Удалении яичников у животных, т.е. в отсутствии эстрогенов, сопровождается увеличением ЭРα-позитивных клеток и снижением прогестероновых рецепторов в вагинальном эпителии, а при инфузии эстрадиола отмечается обратный дозозависимый эффект [27]. Предполагается, что подобный механизм регуляции предотвращает избыточную пролиферацию вагинального эпителия при колебании уровня эстрадиола в ходе менструального цикла. Данные о влиянии заместительной гормональной терапии (ЗГТ) эстрогенами на экспрессию эстрогеновых рецепторов во влагалище женщин постменопаузального возраста достаточно противоречивы. В большинстве работ отмечено увеличение экспрессии и иммунореактивности ЭРα и ЭРβ в вагинальных тканях как при лечении комбинированными пероральными контрацептивами (КОК), так и при местной эстрогенотерапии [19, 28, 29]. Тем не менее есть данные, что интравагинальное введение эстрогенов в отличие от КОК не влияет на экспрессию этих рецепторов [30]. Полученные в нашем исследовании результаты могут свидетельствовать либо о первоначальном снижении местной чувствительности к эстрогенам у девочек с ВДКН, что привело к послеоперационному стенозу интроитуса и потребовало повторного хирургического вмешательства, либо о снижении экспрессии ЭР в тканях влагалища непосредственно после проведения интроитопластики. В некоторых исследованиях на животных отмечалось снижение экспрессии мРНК АР после удаления яичников и ее увеличение после введения физиологических доз эстрадиола [31, 32]. В других работах не находили изменений в экспрессии АР [27]. Нами не было выявлено статистически значимой разницы в экспрессии АР в вагинальных тканях у девочек, получавших и не получавших интравагинально крем Овестин.

При иммуногистохимическом исследовании ЭР и АР у женщин-транссексуалов, готовящихся к операции по смене пола на мужской, было показано, что длительный прием препаратов тестостерона приводит к истончению и снижению пролиферации вагинального эпителия (отсутствие в эпидермисе клеток поверхностного слоя, истончение промежуточного слоя), а также к снижению в тканях влагалища экспрессии мРНК ЭРα и ЭРβ и к увеличению экспрессии мРНК АР [33, 34]. По нашим данным, статистически значимой корреляции между количеством рецепторов ЭРα, ЭРβ, АР и уровням андрогенов (тестостерон, 17-ОПГ) выявлено не было. Этот результат может объясняться и тем фактом, что все пациентки перед проведением II этапа феминизирующей пластики находились в состоянии компенсации в течение 6-12 мес, т.е. имели низкий уровень тестостерона в сыворотке. Доля клеток, несущих рецепторы, и их локализация во влагалище не различались между пациентками с СТ и ПВ формами с различной вирилизацией гениталий, а также с регулярным и нерегулярным менструальным циклом. Последнее подтверждается данными литературы, свидетельствующими об отсутствии изменений экспрессии ЭР и АР в зависимости от возраста, фазы и характера менструального цикла [16].

Заключение

В тканях наружных половых органов девочек с адреногенитальным синдромом определяется экспрессия как ЭР, так и АР. Их количество и распределение в МПГ у допубертатных пациенток и во влагалище у девочек в период полового созревания не зависит от формы ВДКН, степени вирилизации наружных половых органов и уровня андрогенов в крови. У пациенток с ВДКН, подвергающихся повторной интроитопластике, отмечается снижение экспрессии рецепторов к эстрогенам в слизистой влагалища при неизмененной экспрессии АР, что может указывать на снижение у них чувствительности к местной терапии эстрогенами.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - И.В. Копылова, Т.М. Глыбина, М.А. Карева

Сбор и обработка материала - И.В. Копылова, Т.М. Глыбина, В.Ю. Сысоева

Статистическая обработка данных - И.В. Копылова

Написание текста - И.В. Копылова

Редактирование - М.А. Карева, В.Ю. Сысоева

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail