1. Гормональное лечение до оперативного вмешательства

Частота выявления случаев идиопатического гипогонадотропного гипогонадизма (ИГГ) и синдрома Кальмана (Kals) у мужчин составляет приблизительно 1:100 000; в основе этих синдромов лежит недостаточность секреции гипоталамического гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ), вследствие чего нарушается гипофизарная секреция гонадотропинов [1].

Протоколы, используемые для лечения гипогонадотропного гипогонадизма, отличаются большой вариабельностью. Например, 2000 МЕ хорионического гонадотропина человека (чХГ) могут назначать до 3 раз в неделю в течение 3—6 мес либо отдельно, либо со 150 МЕ человеческого менопаузального гонадотропина (чМГ), состоящего из равных долей ФСГ и ЛГ. Гонадотропины и ГнРГ стимулируют сперматогенез практически одинаково. Пульсирующая ГнРГ-терапия также используется при гипоталамических расстройствах, но ее преимущество перед гонадотропинами весьма спорно; кроме того, она обходится гораздо дороже.

Неопущение яичек (крипторхизм) и малый их объем обычно рассматриваются как отрицательные прогностические факторы для извлечения сперматозоидов. Но даже у пациентов, которые изначально имеют очень маленький объем яичек, успешное лечение возможно. Положительный ответ на проводимую терапию у пациентов с гипогонадотропным гипогонадизмом может быть связан с остаточной функцией гипофиза [2].

D. Buchter и соавт. [3] представили результаты терапии 42 мужчин со вторичным гипогонадизмом. Пациенты с гипоталамическими нарушениями (11 с ИГГ и 10 с Kals) получали ГнРГ (группа Ia) или сочетание чХГ/чМГ (группа Ib), а пациенты с гипопитуитаризмом (n=21, группа II) — только чХГ/чМГ.

В общей сложности было проведено 57 курсов индукции сперматогенеза, и 36 из них — с целью наступления беременности у партнерши. Проводимая терапия в течение 5—12 мес позволила удвоить объем яичек, и в 57 курсах лечения у 54 пациентов удалось восстановить сперматогенез, о чем свидетельствовало появление единичных сперматозоидов в эякуляте. Беременность наступила в 26 из 36 курсов ЭКО/ИКСИ/микро-ТЕСЕ. В лечении данной группы мужчин в целом наблюдалась тенденция к большей продолжительности индукции сперматогенеза, особенно у пациентов с двусторонним крипторхизмом по сравнению с мужчинами с тяжелой патозооспермией и нормальным уровнем гонадотропинов.

У мужчин с ИГГ или Kals, леченных препаратами чХГ/чМГ или ГнРГ, не было статистически значимых различий по продолжительности терапии для появления сперматозоидов или наступления беременности. Большое значение для достижения беременности в супружеской паре имел возраст партнерш.

I. Fahmy и соавт. [4] исследовали возможность использования сперматозоидов, полученных при микро-ТЕСЕ, для процедуры ИКСИ у 15 мужчин с азооспермией при гипогонадотропном гипогонадизме после предварительной дооперационной терапии гонадотропинами. Все пациенты получали по 75 МЕ чМГ 3 раза в неделю и 5000 МЕ чХГ 1 или 2 раза в неделю в течение ≥6 мес до лечения методом ЭКО/ИКСИ/микро-ТЕСЕ. У 11 (73%) из 15 пациентов были получены сперматозоиды из ткани яичка и использованы для оплодотворения методом ИКСИ; наступили две биохимические беременности, которые не развились в клинические (при УЗИ плодное яйцо не визуализировалось). Продолжили терапию гонадотропинами 9 пациентов в течение последующих 6 мес. Сперматозоиды в эякуляте появились у 3 из них. Остальные 6 пациентов прошли повторный цикл ЭКО/ИКСИ, 1 мужчина отказался от повторной операции микро-ТЕСЕ (для оплодотворения были использованы криоконсервированные сперматозоиды), и 5 мужчин прошли повторную операцию микро-ТЕСЕ для получения свежих сперматозоидов. В результате наступила одна биохимическая и три клинические маточные беременности, из которых одна беременность на тот период времени пролонгировалась, и родились 3 здоровых доношенных детей.

В общей сложности, из 17 циклов ИКСИ сперматозоидами, полученными с помощью микро-ТЕСЕ, оплодотворение было достигнуто в 41,7% случаев, а суммарная частота беременности составила 20%.

Сохранение малых размеров яичек и азооспермии свидетельствовало об отсутствии ответа на гормональную терапию у пациентов. Отрицательный результат, по мнению авторов [5], был связан как с изначально маленьким объемом яичек, так и со зрелым возрастом пациентов. ФСГ, благодаря его действию на клетки Сертоли и гематотестикулятный барьер, играет важную роль в регуляции микроваскулярности яичек. Преждевременные повторные прерывания циклов гормональной терапии могут привести к фиброзным изменениям яичка, что, в конечном счете, снижает эффект гормональной терапии. В этом исследовании все пациенты получали гормональную терапию периодически, что замедляло реакцию после отмены лечения. Необходимо отметить, что при гистопатологическом исследовании тканей яичек 3 пациентов отмечалась обширная гиалинизация семенных канальцев. Частота оплодотворения (41,7%) и частота наступления беременности в цикле ИКСИ (17,6%) оказались значительно ниже, чем в случаях обструктивной азооспермии (ОА) — 57,9 и 34,5% соответственно, и очень сходными с данными, полученными у пациентов с необструктивной азооспермией (НОА) — 41,2 и 16,6% соответственно.

C. Akarsu и соавт. [6] провели лечение гонадотропинами 10 мужчин с гипогонадотропным гипогонадизмом, олигоспермией или азооспермией секреторного типа. Терапия перед микрохирургическим извлечением сперматозоидов — (микро-ТЕСЕ) для оплодотворения в программе ЭКО/ИКСИ продолжалась не менее 10 мес. Сперматозоиды были получены и заморожены у всех мужчин. В 6 циклах ЭКО/ИКСИ были использованы свежеполученные сперматозоиды, в 4 циклах — размороженные. В циклах, в которых использовались размороженные сперматозоиды, не наступило ни одной беременности, тогда как в циклах с использованием свежих сперматозоидов были получены 3 клинические беременности, из которых 2 успешно завершились рождением 3 здоровых детей.

Таким образом, в большинстве исследований подчеркивается необходимость длительного лечения гипогонадотропного гипогонадизма для предоперационной подготовки. По мнению авторов, мужчинам с азооспермией при гипогонадотропном гипогонадизме можно предложить терапию гонадотропинами в течение 6 мес и более, так как такая терапия улучшает результаты ЭКО/ИКСИ/микро-ТЕСЕ.

У пациентов с гипогонадотропным гипогонадизмом, проходящих гормональное лечение, сперматозоиды появляются в семенных канальцах яичка задолго до их появления в эякуляте. Таким пациентам должен быть предложен метод ЭКО/ИКСИ/микро-ТЕСЕ для скорейшего наступления беременности.

2. Эндокринные факторы прогноза результативности микро-ТЕСЕ

Выявление дополнительных факторов, которые позволили бы более точно прогнозировать исход ТЕСЕ, и тем самым отбирать пациентов с наилучшей перспективой этой процедуры, имеет большое значение.

R. Ramasamy и соавт. [7] выполнили операцию микро-ТЕСЕ с последующей процедурой ИКСИ у 792 мужчин с НОА. Мужчины были разделены на четыре группы в зависимости от уровня сывороточного ФСГ: <15, 15—30, 31—45 и >45 МЕ/мл. Сперматозоиды из ткани яичка были успешно извлечены у 60% мужчин. Частота извлечения сперматозоидов в группах мужчин с уровнем ФСГ 15—30, 31—45 и >45 МЕ/мл составила 60, 67 и 60% соответственно, что было выше, чем в группе мужчин с уровнем ФСГ <15 МЕ/мл (51%). От тех мужчин, от которых были получены сперматозоиды, наступление клинических беременностей и частота живорожденных детей были одинаковыми в четырех группах (46, 50, 52, 46 и 38, 45, 44, 36% соответственно). Частота получения сперматозоидов при микро-ТЕСЕ, пригодных для дальнейшего использования, у мужчин с повышенным уровнем ФСГ была такой же, как и у мужчин с более низким его уровнем. Результаты микро-ТЕСЕ отличались от полученных этими авторами ранее, когда вероятность извлечения сперматозоидов при обычной биопсии у мужчин с повышенным уровнем ФСГ была очень низкой. По мнению авторов [7, 8], высокий уровень ФСГ не является противопоказанием для микрохирургического извлечения сперматозоидов у мужчин с НОА. Другие исследователи [9, 10] также не отмечали связи между объемом яичек и уровнем ФСГ с результативностью микро-ТЕСЕ.

T. Mostafa и соавт. [11] определяли уровни антимюллерова гормона (АМГ) в семенной плазме у фертильных и бесплодных мужчин. Было проанализировано 84 случая. Пациенты были разделены на четыре группы: с нормозооспермией (НС) (n=16), с олигоастенотератозооспермией (ОАТ) (n=15), с азооспермией: ОА (n=13) и НОА (n=40).

Группа пациентов с НОА была разделена на две подгруппы: с неудачными (n=19) и успешными результатами по частоте извлечения сперматозоидов (sperm retrieval rate — SRR) (n=21). Средний уровень AMГ в семенной плазме был значительно выше в группе у фертильных мужчин, чем у пациентов с ОАТ (41,5±10,9 пмоль/л против 30,5±10,3 пмоль/л, p<0,05). AMГ не был обнаружен ни у одного из пациентов с ОА. Уровень АМГ положительно коррелировал с объемом яичка (r=0,329; p=0,005), количеством сперматозоидов (r=0,483; p=0,007), процентом подвижности сперматозоидов (r=0,419; p=0,021); и отрицательно — с процентом морфологически ненормальных сперматозоидов (r=–0,413; p=0,023). Незначительная корреляция имелась с возрастом мужчин (r=–0,155; p=0,414) и уровнем ФСГ в плазме (r=–0,014; p=0,943). У пациентов с НОА AMГ в семенной плазме был обнаружен в 23 из 40 случаев, 14 (57,5%) из них были с успешными микро-ТЕСЕ; в 17 (58,2%) из 40 случаев АМГ обнаружен не был, 10 из них были с неудачными микро-ТЕСЕ. M. Taymour и соавт. [12] также не выявили АМГ в семенной плазме пациентов с ОА в 100% случаев. Однако, по мнению авторов, уровень AMГ в семенной плазме является плохим предиктором успешности извлечения сперматозоидов у пациентов с НОА.

Ингибин секретируется клетками Сертоли и участвует в регуляции секреции гипофизарного ФСГ; наибольшую роль у мужчин играет его изоформа В. У мужчин, страдающих бесплодием, уровень ингибина-В коррелирует с уровнем ФСГ в сыворотке, количеством сперматозоидов в эякуляте и объемом яичек. Однако ни ингибин-В, ни ФСГ, ни их сочетание в сыворотке не позволяют точно предсказать наличие сперматозоидов в биоптатах яичек. Таким образом, роль уровня ингибина-B в сыворотке в качестве предиктора присутствия в яичках сперматозоидов остается недоказанной.

J. Ballesca и соавт. [13] изучали информативность уровня ингибина-В в отношении успешного извлечения сперматозоидов при микро-ТЕСЕ. Операцию выполняли у бесплодных пациентов с НОА (n=17), у мужчин контрольных групп с ОА (n=22) и доноров спермы с НС (n=29). При НОА уровни ФСГ были выше (p<0,01), а ингибина-В — значительно ниже (р<0,001), чем в контрольных группах. У тех пациентов, у которых удалось извлечь сперматозоиды, концентрация в сыворотке крови ингибина-В была значительно выше, чем в случаях безуспешной операции, но различия в уровнях ФСГ и объеме яичек между этими группами отсутствовали. Именно уровень ингибина-В >40 пг/мл (чувствительность 90%, специфичность 100%), а не ФСГ определял различия между успешными и неуспешными ТЕСЕ. Поэтому авторами был сделан вывод, что по уровню ингибина-В в сыворотке можно судить о сперматогенезе. При сопоставлении уровня ингибина-В в сыворотке с гистологией биоптатов тестикулярной ткани S. von Eckardstein и соавт. [14] нашли, что у мужчин с нормальным сперматогенезом (n=9) уровень ингибина-В составляет 238±32 пг/мл; у пациентов с остановкой развития зародышевых клеток сперматогенеза (n=15) — 102±18 пг/мл; у пациентов с гипосперматогенезом (n=23) — 98±16 пг/мл; при очаговом Сертоли-клеточном синдроме (СКС) (n=26) — 41±6 пг/мл и при полном СКС (n=18) — 27±8 пг/мл. Процент канальцев при СКС, а также число канальцев с удлиненными сперматидами коррелировал с уровнем ингибина-B больше (r=–0,58; p<0,01), чем с ФСГ (r=0,34; р<0,05). Однако, по мнению авторов, ни ФСГ, ни ингибин-В по отдельности не могут точно предопределять тип повреждения сперматогенеза.

L. Tunc и соавт. [15] также оценивали роль уровней ФСГ, ингибина-В и объема яичек в качестве предикторов успешности извлечения сперматозоидов (SRR) при ТЕСЕ в соответствии с гистологическим диагнозом у 52 мужчин с НОА. Операция была успешной у 31 (59,6%) пациента. Уровень ингибина-B 6,25 пг/мл лучше разграничивал успешные и неудачные микро-TEСE, чем другие показатели (чувствительность 90%), но его специфичность (14%) и диагностическая точность (53,8%) были очень низкими. О наличии сперматозоидов лучше свидетельствовало сочетание двух параметров, но и это не являлось абсолютно надежным: операция микро-TEСE могла быть успешной даже в тех случаях, когда уровни обоих гормонов находились за пределами пороговых значений.

Y. Nagata и соавт. [16] оценивали прогностическую значимость уровня ингибина-B в семенной плазме, который непосредственно отражает секрецию клеток Сертоли, в отношении успешности получения сперматозоидов при ТЕСЕ у мужчин с НОА. Уровень ингибина-B измеряли иммуноферментным методом. Сперматозоиды из ткани яичка были получены у 17 (27,4%) из 62 пациентов. Уровни ФСГ в сыворотке были значительно ниже, а концентрации ингибина-B в сыворотке и семенной плазме — значительно выше, чем у пациентов, у которых получить сперматозоиды не удалось. В соответствии с анализом ROC-кривой, наилучший пороговый уровень ингибина-B в семенной плазме составлял 27,0 пг/мл (чувствительность 88,2%, специфичность 93,3%); тогда как пороговый уровень ингибина-В в сыворотке (34,0 пг/мл) обладал меньшей чувствительностью (70,6%) при специфичности 95,6%. Площадь под ROC-кривой для уровня ингибина-B в семенной плазме была значительно больше, чем для уровня ФСГ в сыворотке и объема яичек. Мультивариантный анализ логистической регрессии показал, что только уровень ингибина-B в семенной плазме является независимым предиктором наличия сперматозоидов в ткани яичек при НОА.

E. Duvilla и соавт. [17] провели предварительное проспективное исследование прогностической ценности уровней ингибина-В и АМГ в семенной плазме в отношении получения сперматозоидов из яичка при микро-ТЕСЕ у 68 пациентов с НОА и в контрольных группах (47 мужчин с НС и 28 с олигоспермией). Уровни ингибина-В и АМГ в семенной плазме значительно различались между этими группами. Средние уровни АМГ в семенной плазме зависели от этиологии азооспермии. Количество извлеченных сперматозоидов значимо коррелировало с уровнями ингибина-B (но не АМГ) в семенной плазме. Также выявлена корреляция между уровнями ингибина-В в семенной плазме и сыворотке.

A. Tsujimura и соавт. [18] в ретроспективном исследовании 100 больных с НОА с помощью многофакторного логистического моделирования проанализировали 9 предоперационных факторов, включая возраст пациентов, объем яичек и эндокринологические данные. Сперматозоиды были успешно получены у 41 (41%) пациента. Авторы нашли, что наибольшей информативностью из предоперационных факторов обладают концентрации ФСГ, общего тестостерона (ТТ) и ингибина-В, и предложили формулу для расчета вероятности успешного исхода микродиссекции:

P = [1 + ехр (5,201 – 0,048 × ФСГ – 0,449 × TT – 0,021 × ингибин-B)](–1).

Чувствительность и специфичность результатов расчета по этой формуле составляли соответственно 71,0 и 71,4%.

Таким образом, по мнению авторов, прогностическое значение каждого параметра в отношении успеха микро-ТЕСЕ достаточно низка. Необходимо исследовать как можно большее число параметров как в сыворотке, так и в семенной плазме.

3. Молекулярно-генетические маркеры остаточного сперматогенеза — предикторы успешного получения сперматозоидов при микро-ТЕСЕ у пациентов с НОА

ТЕСЕ с последующей процедурой ИКСИ в последние годы считается первой линией лечения бесплодных пациентов с НОА. Несмотря на новые модификации ТЕСЕ [19], SRR при этой операции остается низкой (примерно 40—60%). На сегодняшний день не выявлено ни одного достоверного предиктора успешного SRR для мужчин с НОА. Идентификация новых молекулярно-генетических маркеров остаточного сперматогенеза, позволяющих прогнозировать получение сперматозоидов при обычной ТЕСЕ или микро-ТЕСЕ у пациентов с НОА, представляется крайне перспективным направлением исследований.

Пациенты с различными формами азооспермии имеют генетические особенности гамет. L. Rodrigo и соавт. [20], проводя цитогенетическое исследование хромосом 13, 18, 21, Х и Y в 7 образцах тестикулярных сперматозоидов (метод флуоресцентной гибридизации in situ, FISH) у мужчин с ОА и в 13 образцах пациентов с НОА, выявили повышение частоты хромосомных аберраций, особенно при НОА. Отмечено повышение дисомии половых хромосом — 29% (p<0,01) у пациентов с ОА; у мужчин с НОА чаще выявлялась диплоидия — в 54% (р<0,0001) и дисомия 13 (р<0,0001), 21 (р<0,001) и половых хромосом (р<0,0001) по сравнению с контрольной группой. В тестикулярных сперматозоидах пациентов с азооспермией чаще обнаруживаются хромосомные аномалии (в основном половых хромосом), особенно у пациентов с НОА.

Молекулярно-генетическим маркером является гомеобокссодержащий ген ESX1, локализованный в Х-хромосоме и экспрессирующийся в яичках, плаценте, мозге и легких человека. Его экспрессия специфична для пре- и постмейотических зародышевых клеток семенников мышей. E. Bonaparte и соавт. [21] проводили анализ гена ESX1 в биопсийном материале ткани яичка у 81 мужчины с различными нарушениями сперматогенеза при НОА и с интактным сперматогенезом при ОА. Экспрессия гена наблюдалась в 62 (95,4%) из 65 образцов с интактным сперматогенезом (при ОА) и его нарушениями от неполного СКС до полной остановки сперматогенеза. Напротив, транскрипция ESX1 была выявлена лишь в незначительном количестве случаев полного СКС — 3 (18,7%) из 16 пациентов. Полученные данные указывают на наличие выраженной корреляции между экспрессией ESX1 и сохранностью какого либо этапа сперматогенеза; мРНК ESX1 обнаруживалась во всех случаях присутствия зародышевых клеток во всех семенных канальцах или в ограниченных фокусах вне зависимости от стадии остановки развития.

M. Ando и соавт. [22] выясняли, можно ли использовать присутствие мРНК некоторых молекулярных маркеров сперматогенеза в качестве предикторов успешного получения сперматозоидов при микро-ТЕСЕ у пациентов с НОА. У 52 пациентов с НОА методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени исследовали экспрессию генов VASA, ODF1, ODF2 и SMCP в митохондриях сперматозоидов, полученных из ткани яичка.

Ген VASA кодирует семейство DEAD-белков АТФ-зависимой РНК-геликазы; он содержится в эмбриональных и зрелых половых клетках обоих полов и играет ключевую роль в развитии зародыша. Ген ODF кодирует 2 типа белков — ODF1 и ODF2, входящих в структуры цитоскелета хвоста сперматозоидов и влияющих на их подвижность и морфологию. SMCP является структурным белком, богатым цистеином и пролином, который связан с кератиновой капсулой оболочки митохондрий и с окружающей внешней плотной оболочкой аксонемы жгутика сперматозоида [23, 24].

Не было выявлено существенных различий в возрасте пациентов, объеме яичек, уровнях ФСГ, ЛГ и тестостерона между группами успешной и неуспешной ТЕСЕ, однако доля пациентов с СКС в успешной группе ТЕСЕ была значительно ниже, чем в неуспешной. Экспрессия мРНК генов VASA, ODF1, ODF2, и SMCP в успешной группе была значительно выше, чем в неуспешной. Как показал гистологический анализ, значимым предиктором получения сперматозоидов при микро-ТЕСЕ может быть только мРНК VASA. Эти данные позволяют предположить, что измерение уровня мРНК VASA в яичках является полезным дополнением к обычным параметрам прогноза получения сперматозоидов при микро-ТЕСЕ у пациентов с НОА. Необходимо подчеркнуть, однако, что размер выборки из 52 пациентов для такой распространенной патологии, как НОА, недостаточен для надежного вывода. Поскольку при экспрессии гена VASA вероятность успешного извлечение сперматозоидов при микро-ТЕСЕ была значительно выше, чем в случаях отсутствия его экспрессии, авторы считают этот тест абсолютно необходимым и рекомендуют проводить его у гораздо большего числа пациентов с НОА.

A. Zalata и соавт. [25] оценивали акросомальную активность сперматозоидов, фрагментацию ДНК и экспрессию гена CLU у 124 мужчин с НС, астенозооспермией, астенотератозооспермией и олигоастенотератоспермией. У человека ген CLU кодирует кластерин — гетеродимерный белок, участвующий в ряде процессов, включая апоптоз, регуляцию опосредованного комплементом лизиса клеток, рециклирование мембран и др. Этот белок имеет несколько названий: димерный кислый гликопротеин, репрессируемый тестостероном маркер простаты-2, сульфатированный гликопротеин-2 и ингибитор лизиса, опосредованного комплементом. Кластерин был обнаружен в семенной жидкости в 1988 г. У человека ген GLU локализован на хромосоме 8 (8p21). Этот ген весьма консервативен (70—80% гомологии у разных видов млекопитающих). Кластерин содержится в большинстве тканей и биологических жидкостей млекопитающих. Авторы анализировали экспрессию гена CLU в семенниках у фертильных и бесплодных мужчин. Уровни мРНК CLU и кластерина в образцах спермы бесплодных пациентов с ОАТ, астенотератозооспермией и астенозооспермией были значительно выше, чем у здоровых фертильных мужчин. Экспрессия гена CLU отрицательно коррелировала с количеством сперматозоидов, их подвижностью, индексом акросомальной активности, линейным индексом и линейной скоростью, а также положительно коррелировала с процентом сперматозоидов аномальной формы и фрагментацией ДНК.

Таким образом, в настоящее время ведется активный поиск генетических предикторов обнаружения остаточного сперматогенеза в ткани яичка, так как ни один из известных на сегодня маркеров, за исключением делеций в субрегионах AZFa и AZFb, не является абсолютно надежным прогностическим фактором.

4. Преимущества методики микро-ТЕСЕ

Выявление расширенных участков семенных канальцев, нередко единичных, с сохраненным сперматогенезом — основная задача ТЕСЕ; дополнительное оптическое увеличение позволяет отличать более крупные беловатые и прозрачные канальцы с активным сперматогенезом от тех, где продукция сперматозоидов отсутствует. Такой подход сопряжен с удалением меньшего количества тестикулярной ткани, что крайне важно при имеющейся гипоплазии яичек. Кроме того, идентификация бессосудистых участков при разрезе белочной оболочки практически сводит к минимуму вероятность повреждения сосудов.

P. Schlegel [19] сравнил две группы пациентов: 22 мужчинам проводилась стандартная множественная биопсия, 27 — микро-ТЕСЕ. Автор наблюдал значительное повышение SRR при проведении последней (63% против 45%), но в данной работе не были представлены результаты гистологического исследования биоптатов. У пациентов, подвергшихся микро-ТЕСЕ, удалялось значительно меньшее количество тестикулярной ткани (9,4 мг против 720,0 мг). К 2006 г. группа P. Schlegel провела 684 микро-ТЕСЕ у 563 мужчин; SRR при этом составляла 61% [26].

В ретроспективном исследовании H. Okada и соавт. [27] сравнивали результаты обычной ТЕСЕ (24 случая) и микро-ТЕСЕ (76). При микро-ТЕСЕ имела место значительно более высокая SRR, чем при обычной ТЕСЕ (44,6% против 16,7%). Кроме того, только микро-ТЕСЕ позволяла получать сперматозоиды у пациентов с синдромом Клайнфельтера. При дополнительном анализе выяснилось, что микро-ТЕСЕ обеспечивала достоверно бóльшую SRR только при СКС (33,9% против 6,3%; р=0,04), но не при остановке сперматогенеза (MA) (75% против 37,5%; р=0,2). Возможное объяснение этих различий заключается в том, что в случаях МА, несмотря на присутствие очагов активного сперматогенеза, все канальцы однообразны, тогда как при СКС различный внешний вид канальцев позволяет идентифицировать участки сперматогенеза.

В сравнительном исследовании M. Amer и соавт. [28], включавшем 116 мужчин, была показана значительно бóльшая SRR при ТЕСЕ с дополнительной микроскопией, чем при обычной ТЕСЕ (47% против 30%). Однако высокий успех операции наблюдался только при той или иной степени гипосперматогенеза. Недостаток этого исследования заключался в том, что, поскольку биопсия производилась с диагностической целью, в группе обычной ТЕСЕ был получен только один биоптат, тогда как в микрохирургической группе — два.

Более крупное исследование R. Ramasamy и соавт. [8], включавшее 435 мужчин (83 — обычная ТЕСЕ и 460 — микро-ТЕСЕ), обнаружило существенно бóльшую SRR только в случаях гипосперматогенеза (81% против 50%), но не в случаях СКС или остановки развития зародышевых клеток. Однако несбалансированность двух групп пациентов в этом исследовании не позволяет сделать надежный вывод [8].

SRR при микро-ТЕСЕ зависит не только от патоморфологической картины ткани яичек, но и от их объема. В ретроспективном исследовании J. Mulhall и соавт. [29] показали, что только при объеме яичек ниже 10 мл SRR при микро-ТЕСЕ выше, чем при обычной ТЕСЕ (42% против 27%). Обе группы были сравнимы по возрасту и гистологической картине яичек. Дополнительное преимущество микро-ТЕСЕ заключалось в меньшей необходимости двусторонней биопсии (42% против 82%) и меньшем числе разрезов белочной оболочки яичка (1,4±0,4 против 3,2±1,2).

В отличие от этих авторов, A. Tsujimura и соавт. [30] сообщили о сравнимых результатах обычной ТЕСЕ и микро-ТЕСЕ (SRR 35,1 и 42,9% соответственно; p>0,05). Пациенты обеих групп имели одинаковый возраст, эндокринный профиль, гистологическую картину и объем тестикул. При микро-ТЕСЕ время операции было значительно больше (146,8 мин против 68,2 мин). Сперматозоиды были получены во всех случаях гомогенного утолщения семенных канальцев и только у 17 (65,4%) из 26 пациентов с гетерогенными канальцами.

K. Okubo и соавт. [31] на первом этапе у пациентов с НОА проводили обычную ТЕСЕ. Если сперматозоиды были получены, то дальнейшее вмешательство прекращали. Микро-ТЕСЕ проводили только тем пациентам, у которых обычная ТЕСЕ оказалась неудачной. Сперматозоиды были успешно извлечены при обычной ТЕСЕ у 4 (24%) из 17 пациентов с НОА. Остальные 13 пациентов подверглись микродиссекции, и сперматозоиды были успешно извлечены у еще 4 из них. Применение метода микро-ТЕСЕ привело к улучшению SRR с 24 до 48%. Ни у одного из пациентов не было отмечено осложнений. ИКСИ было выполнено у 5 из 8 пациентов с успешным SRR, и у 4 пар наступила маточная беременность, завершившаяся рождением здоровых детей. Эти результаты указывают на целесообразность применения микро-ТЕСЕ для увеличения вероятности получения сперматозоидов у мужчин с НОА и совпадают с мнением других авторов [32].

A. Tsujimura и соавт. [33] также выявили сравнимую частоту SRR у пациентов, подвергшихся как первичной, так и микро-ТЕСЕ, проведенной после безуспешной обычной ТЕСЕ (45,7% против 44,0%). Необходимо отметить, что в данном исследовании 30% пациентов проводили только одностороннюю обычную TEСE и только у 9 из них была проведена множественная биопсия. Тем не менее методика микро-ТЕСЕ оказалась успешной у 3 из 9 пациентов, у которых ранее проведенная двусторонняя ТЕСЕ c множественными биопсиями не увенчалась успехом.

R. Ramasamy и P. Schlegel [34] сообщили об отсутствии порога для ранее произведенных отрицательных биопсий перед микродиссекцией, хотя отметили, что у пациентов, подвергавшихся ранее 3—4 биопсиям, SRR была значительно ниже, чем у тех, кому производили 1—2 биопсии (23% против 51%).

5. Техника выполнения операции. Эмбриологический этап выделения сперматозоидов из тестикулярной ткани

Процедура прямого микроскопического выявления и извлечения функционирующих (расширенных) семенных канальцев (микродиссекция, микро-ТЕСЕ) впервые была осуществлена P. Schlegel в 1999 г. [19]. Как и при стандартной мультифокальной биопсии, использовалось оптическое увеличение (×6—8) для визуализации кровеносных сосудов под поверхностью влагалищной оболочки, что позволяло производить разрезы в аваскулярных зонах яичка. При микрохирургической биопсии вместо нескольких разрезов проводилось широкое рассечение белочной оболочки вблизи срединной части яичка для оптимальной визуализации его паренхимы с минимальным нарушением кровоснабжения. Дальнейшее прямое изучение паренхимы яичка осуществлялось под операционным микроскопом при 20—25-кратном увеличении. Во время этой процедуры идентифицировали отдельные непрозрачные белесые и более крупные по диаметру семенные канальцы. Проводился забор образцов ткани из паренхимы яичка весом всего 2—10 мг, что было значительно меньше, по сравнению со стандартной биопсией, при которой, в зависимости от объема яичка, извлекалось 250—750 мг ткани.

Микрохирургическая биопсия прекращалась, когда сперматозоиды были получены, а дальнейшее вмешательство могло нарушить кровоснабжение яичка. Из каждого биоптата выделяли небольшие участки семенных канальцев для оценки эффективности обоих методов. Каждый образец ткани нарезали на более мелкие кусочки, что позволяло освободить сперматозоиды из семенных канальцев. Затем извлеченную ткань суспензировали и несколько раз аспирировали катетером 24G (Angiocath). Небольшие аликвоты исследовали под фазовоконтрастным микроскопом при 200-кратном увеличении. Данный метод повышал возможность извлечения сперматозоидов у мужчин с НОА.

M. Ostad и соавт. [35] исследовали каждый извлеченный образец тестикулярной ткани путем помещения микрокапли суспензии в камеру для подсчета клеточных элементов (Cell-Vu, Cat. No. DR600; Erie Scientific Co., Erie, PA, США) и определяли в нем наличие и количество сперматозоидов. Если сперматозоиды в исходном образце не были обнаружены, то брали следующие образцы из ипсилатерального, а затем и из контрлатерального яичка до тех пор, пока не находили сперматозоиды или принимали решение, что дальнейшее вмешательство может привести к ухудшению кровоснабжения яичка. Если нормальные канальцы не обнаруживались, то извлекали любые другие канальцы, которые отличались только размерами. Если все канальцы имели идентичную структуру, то выполнялась не микро-ТЕСЕ, а стандартная биопсия. Все хирургические процедуры проводились последовательно одним и тем же хирургом. В образцах, полученных с помощью микро-ТЕСЕ и стандартной биопсии, сравнивали количество полученных сперматозоидов и объем извлеченной ткани. После микро-ТЕСЕ лучшие образцы тестикулярной ткани инкубировали в течение ночи в среде для отмывки сперматозоидов при 37 °С. Каждый образец анализировался опытным эмбриологом. На следующий день проводили пункцию фолликулов у партнерши. Оплодотворение ооцитов осуществляли методом ИКСИ.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о статистически значимых различиях в количестве полученных сперматозоидов и объеме извлеченной ткани в пользу микро-ТЕСЕ по сравнению со стандартной биопсией [27, 35, 36].

R. Ramasamy и соавт. [37] оценивали время проведения микродиссекции как в успешных, так и в неудачных микрохирургических процедурах. В общей сложности были проанализированы 793 операции микро-ТЕСЕ у мужчин с НОА, которые прошли первую попытку с января 2000 по сентябрь 2009 гг. Все операции выполнял один уролог. Из клинических факторов учитывали возраст пациента, наличие варикоцеле, объем яичек. Гормональная оценка включала определение уровня ФСГ в течение предшествующих 2 мес. О гистологии яичка судили по результатам предыдущих биопсий, сделанных в другом месте, или по данным интраоперационной экспресс-биопсии. Анализ кариотипа был проведен у всех пациентов. Диагноз азооспермии у всех пациентов был подтвержден не менее чем 2-кратным семиологическим анализом в соответствии с рекомендациями ВОЗ от 1999 г. Оперативное время рассчитывалось с момента разреза до момента прекращения процедуры.

Сперматозоиды были успешно получены у 57% пациентов и обнаруживались в пределах до 2 (1-я группа), 2—4 (2-я группа) и 4—7 ч (3-я группа) в 89, 30 и 37% случаев соответственно. Не существовало различий между группами пациентов в таких предоперационных клинических характеристиках пациентов, как возраст, уровень ФСГ, объем яичек, частота синдрома Клайнфельтера и распространение наиболее частых вариантов гистопатологии. У партнерш тех мужчин 1, 2 и 3-й групп, у которых были получены сперматозоиды, клиническая беременность наступила в 48, 45 и 29% случаев; живые дети родились в 37, 30 и 29% случаев соответственно (р>0,05). Анализ ROC-кривой времени оперативного вмешательства для обнаружения сперматозоидов показал, что оптимальное время составляет 125 мин (AUC 0,81; чувствительность 84% и специфичность 95%).

Вероятность извлечения сперматозоидов при микро-ТЕСЕ была наибольшей в течение первых 2 ч операции (89%). Для 213 (47%) успешных процедур, которые привели к наступлению клинической беременности, среднее время операции составило 1,8 ч (0,5—6,6 ч), а для безуспешных попыток обнаружения сперматозоидов — 2,7 ч (0,8— 7,5 ч). Однако у 37% мужчин сперматозоиды удавалось обнаружить при микро-ТЕСЕ продолжительностью более 4 ч. Ретроспективный анализ данных не выявил конкретного времени, после которого извлечение сперматозоидов оказывалось невозможным.

6. Результативность микро-ТЕСЕ и факторы прогноза получения сперматозоидов в зависимости от гистологии яичек

По данным I. Ghalayini и соавт. [38], микро-ТЕСЕ, проведенная у 65 пациентов, оказывалась более чем в 2 раза результативнее открытой биопсии (68 пациентов); при этом была выявлена связь между частотой обнаружения сперматозоидов, объемом яичек, уровнем ФСГ и ЛГ и гистологическими данными. Уровни тестостерона или пролактина не влияли на успешность обнаружения сперматозоидов. SRR при микро-ТЕСЕ была значительно выше, чем при обычной ТЕСЕ (56,9 и 38,2% соответственно) и положительно коррелировала с объемом яичка, отрицательно — с уровнем ФСГ. У пациентов с гипосперматогенезом при обычной ТЕСЕ сперматозоиды были извлечены в 84%, а при микро-ТЕСЕ — в 92,9% случаев (p=0,3). В случае остановки развития зародышевого эпителия SRR составляла 27,3 и 36,4% соответственно (p=0,6), а при СКС — 6,2 и 26,9% соответственно (p=0,03). Серьезные послеоперационные осложнения отсутствовали у пациентов всех групп, и ни одному из пациентов не потребовалась послеоперационная гормональная терапия гипогонадизма. Авторы рекомендуют проводить микро-ТЕСЕ при гипотрофии яичек и при СКС с высоким уровнем ФСГ.

Для индукции беременности в исходе ЭКО/ИКСИ и микро-ТЕСЕ важно использовать свежеполученные (в день или накануне получения ооцитов), а не замороженные/оттаяные сперматозоиды. Так, J. Schiff и соавт. [39] не получили ни одной беременности при применении размороженных тестикулярных сперматозоидов у пациентов с синдромом Клайнфельтера.

Ранее S. Friedler и соавт. [40] провели ряд исследований, в которых использовали и те, и другие сперматозоиды от мужчин 23—36 лет с немозаичной формой синдрома Клайнфельтера. Исходные уровни ФСГ были повышены, составляя в среднем 38,3±11,4 мМЕ/мл (22—58 мМЕ/мл). Объем яичек колебался от 2 до 4 мл. Зрелые сперматозоиды были найдены при микро-ТЕСЕ у 5 (42%) из 12 пациентов. Часть ткани яичка замораживали. Не было найдено статистически значимых различий в частоте оплодотворения (FR) (66,0% против 58,0%), частоте деления эмбрионов (CR) (98,0% против 90,0%) и частоте имплантации (IR) (33,3% против 21,4%) при использовании свежих и криоконсервированных сперматозоидов. Использование свежих сперматозоидов обусловило 2 одноплодные беременности и одну беременность тройней. После использования замороженных/оттаянных сперматозоидов были получены 2 беременности (в 1 случае родилась двойня и в 1 имел место ранний самопроизвольный выкидыш). Все рожденные дети были генетически здоровыми.

Определение только параметра SRR, по мнению J. Nicopoullos и соавт. [41], недостаточно для оценки эффективности циклов ЭКО/ИКСИ с использованием тестикулярных сперматозоидов от мужчин с НОА. Согласно метаанализу 154 циклов ИКСИ с использованием сперматозоидов, полученных хирургическим путем у мужчин с азооспермией, при НОА показатели FR и IR были значительно ниже, чем после оплодотворения эякуляторными сперматозоидами (р<0,05), но различия в частоте клинических беременностей (PR) в этих группах не достигали статистической значимости (р=0,08). Криоконсервация эпидимальных сперматозоидов не влияла на эффективность программы ЭКО/ИКСИ, а использование замороженных тестикулярных сперматозоидов приводило к снижению FR, существенно не влияя на IR и PR. Эмбрионы, полученные после оплодотворения тестикулярными сперматозоидами мужчин с НОА, чаще имели морфологические нарушения после 2 дней дробления.

Известны лишь немногие исследования, в которых изучалось влияние метода получения сперматозоидов на вероятность конечного успеха. R. Mercan и соавт. [42] на основан?