Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Копылова О.И.

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Кураева Т.Л.

ФГУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации, Москва

Лаврикова Е.Ю.

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Титович Е.В.

ФГУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации, Москва

Никитин А.Г.

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Смирнова Г.Е.

ФГБУ "Эндокринологический научный центр" МЗ РФ, Москва

Петеркова В.А.

Эндокринологический научный центр, Москва

Дедов И.И.

ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России

Носиков В.В.

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Ассоциация гена ССR5 с сахарным диабетом 1-го типа

Авторы:

Копылова О.И., Кураева Т.Л., Лаврикова Е.Ю., Титович Е.В., Никитин А.Г., Смирнова Г.Е., Петеркова В.А., Дедов И.И., Носиков В.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2013;59(2): 3‑6

Просмотров: 202

Загрузок: 3

Как цитировать:

Копылова О.И., Кураева Т.Л., Лаврикова Е.Ю., Титович Е.В., Никитин А.Г., Смирнова Г.Е., Петеркова В.А., Дедов И.И., Носиков В.В. Ассоциация гена ССR5 с сахарным диабетом 1-го типа. Проблемы эндокринологии. 2013;59(2):3‑6.
Kopylova OI, Kuraeva TL, Lavrikova EIu, Titovich EV, Nikitin AG, Smirnova GE, Peterkova VA, Dedov II, Nosikov VV. Association of the CCR5 gene with type 1 diabetes mellitus. Problemy Endokrinologii. 2013;59(2):3‑6. (In Russ.).

?>

Сахарный диабет 1-го типа (СД1) является аутоиммунным заболеванием, характеризующимся лимфоцитарной инфильтрацией островков Лангерганса дендритными клетками (DC), макрофагами и Т-лимфоцитами (CD4+ и CD8+) с последующим разрушением β-клеток [1], но с сохранением α-клеток, секретирующих глюкагон, и δ-клеток, секретирующих соматостатин [1, 2]. Еще одним доказательством развития именно аутоиммунного процесса являются выявляемые в сыворотке крови антитела, специфичные для собственных белков организма. Наиболее важные из таких антител — антитела к инсулину, декарбоксилазе глутаминовой кислоты (GAD65) и внутриклеточной тирозинфосфатазе (IA2) [3].

Главными генами, определяющими предрасположенность к СД1, являются гены класса II (HLA-DRB1, DQB1 и DQA1) главного комплекса гистосовместимости (MHC). Однако манифестация СД1 происходит только в том случае, если наряду с генами комплекса MHC индивид является носителем ряда других предрасполагающих генов. Одним из главных факторов является также воздействие внешней среды, природа которого пока не установлена.

К настоящему времени у русских больных СД1, проживающих в Москве, наряду с генами класса II MHC обнаружена ассоциация еще нескольких генов, предрасполагающих к СД1. Это ген CTLA4, кодирующий поверхностный рецептор Т-клеток [4], ген инсулина (INS) [5], гены PTPN22 и PTPN2, кодирующие тирозиновые фосфатазы [6], и ген SH2B3, кодирующий адаптерный белок Lnk [7].

За исключением гена инсулина, все вышеперечисленные гены кодируют факторы, связанные с формированием иммунного ответа. В связи с этим особое внимание обращает на себя рецептор хемокинов типа 5 (CCR5). Как и все рецепторы, сопряженные с G-белками, CCR5 имеет внеклеточный N-концевой участок, 7 трансмембранных доменов, соединенных внеклеточными и внутриклеточными петлями, и цитоплазматический С-концевой участок [8]. Одновременная экспрессия рецепторов CD4 и CCR5 наблюдается в Т-лимфоцитах, в частности Т-хелперах 1-го типа (Th1), а также в дендритных клетках, моноцитах и макрофагах [9]. Вариант гена CCR5, содержащий делецию 32 п.н. в кодирующей области, приводит к синтезу укороченного и функционально неактивного варианта рецептора из-за сдвига рамки считывания [10]. При этом у гетерозиготных носителей уровень синтеза рецептора CCR5 понижен, а у гомозиготных — синтез функционально активного рецептора CCR5 полностью отсутствует [11].

CCR5 играет важную роль в регуляции иммунного ответа типа Th1, ведущего к аллогенному подавлению β-клеток островков Лангерганса при СД1 [12]. Пониженная экспрессия хемокиновых рецепторов CCR5, ассоциированных с Th1, обнаружена в моноцитах периферической крови больных с недавно выявленным СД1 [13]. Хорошо изучена роль хемокинов в качестве аттрактантов для нативных и эффекторных Т-клеток [8, 14]. В ряде исследований [15] показано, что хемокины имеют важное значение и в регуляции Т-клеточной дифференцировки, а также влияют на поляризацию иммунного ответа по типу Th1 или Th2.

Недавно обнаружено, что аллель del32 гена ССR5 с высокой частотой обнаруживается у носителей аллелей HLA-DRB1*01 и DRB1*04 [16]. Ассоциация варианта del32 гена ССR5 была выявлена с такими аутоиммунными заболеваниями, как рассеянный склероз, целиакия и СД1 [17, 18]. Следует отметить, что носители генотипа del32/del32 гена ССR5 имеют пониженный риск развития СД1 [18]. Механизм развития данных заболеваний сходен и в значительной степени связан с аутоиммунной неспецифичной реакцией Т-лимфоцитов на периферические ткани организма и интолерантностью к антигенам, поступающим с пищей [18].

Однако в двух исследованиях, проведенных на шведской [19] и британской [20] популяциях, ассоциации с СД1 обнаружено не было. Таким образом, возникает вопрос, насколько существенен вклад гена ССR5 (вариант del32) в формирование генетической предрасположенности к СД1 среди русских больных СД1, проживающих в Москве. Именно эта задача и была поставлена в данной работе.

Материал и методы

В работе использовали образцы крови от больных СД1 (177 человек) и здоровых индивидов (408) русского происхождения, любезно предоставленные сотрудниками ФГУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ.

Использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq производства ЗАО «Диалат» (Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» (Москва). Флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез» (Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [21].

Идентификацию генотипов гена CCR5, кодирующего рецептор хемокинов типа 5, проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (TaqMan) на термоциклере ABI 7500 Fast («Applied Biosystems») в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров, 100 нМ зондов, 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50—100 нг геномной ДНК. В составе реакционной смеси для амплификации присутствуют флуоресцентномеченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени и разрушаются Taq-полимеразой, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции в зависимости от наличия мутации. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала.

Условия амплификации фрагмента ДНК: 95 °C/2 мин — 1-й цикл; 94 °C/10 с, 58 °C/60 — всего 40 циклов. Анализ продуктов амплификации проводился методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

Статистический анализ распределения частот и генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат (χ2). Значимыми считали различия при p<0,05. Относительный риск развития заболевания рассчитывали по отношению шансов (OR). OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации, OR >1 как положительную ассоциацию (повышенный риск развития патологии), OR <1 — как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием (пониженный риск развития патологии). Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях случай—контроль» [22].

Результаты и обсуждение

Как в группе больных СД1 («СД+»), так и в группе здоровых индивидов («СД–») преобладал аллель без делеции 32 п.н. (аллель A, более 80%), то же самое характерно и для генотипов (генотип A, более 70%) (см. таблицу).

Различия между частотами аллелей A и del32 в группах «СД+» и «СД–» были статистически незначимыми. В то же время нами были обнаружены статистически значимые различия при сравнении частот генотипов в тех же группах больных (см. таблицу). Наблюдалось увеличение частоты генотипа del32/del32 (p=0,008) в группе больных CД1, что говорит об ассоциации этого генотипа c повышенным риском развития данной патологии и о повышенном риске развития СД1 у носителей генотипа del32/del32.

Наши данные противоречат результатам, полученным на британской популяции и подтвержденным на семьях из нескольких европейских стран [18]. В этом исследовании было показано, что носители аллеля del32 гена ССR5 имеют пониженный риск развития СД1. Следует отметить, что вклад гена ССR5 в формирование предрасположенности к СД1 минимален как в русской, так и в британской популяциях.

Кроме того, в двух исследованиях, проведенных на шведской популяции [19] и на другой выборке из британской популяции [20], ассоциации с СД1 вообще обнаружено не было. Эти противоречия, возможно, связаны с эпистатическим взаимодействием генов комплекса HLA класса II между собой и с генами, включенными в аутоиммунную реакцию, одним их которых является CCR5 [23].

На основании полученных нами данных можно сделать вывод, что носители генотипа del32/del32 гена ССR5 среди русских больных, проживающих в Москве, имеют повышенный риск развития аутоиммунного СД1.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Г. Никитин, В.В. Носиков, И.И. Дедов, О.И. Копылова

Сбор и обработка материала — Т.Л. Кураева, Г.Е. Смирнова, В.А. Петеркова, Е.Ю. Лаврикова, О.И. Копылова

Статистическая обработка данных — А.Г. Никитин, О.И. Копылова

Написание текста — А.Г. Никитин, О.И. Копылова, В.В. Носиков

Редактирование — В.В. Носиков

Конфликт интересов и финансовая заинтересованность авторов отсутствуют.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт 16.512.11.2045) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект 09-04-01443-а).

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail