Множественные иммунорегуляторные нарушения у потомства крыс с экспериментальным гестационным диабетом

За последние годы накоплено много данных, свидетельствующих о важной роли нарушения функционирования центрального органа иммуногенеза – тимуса в патогенезе сахарного диабета (СД) [1, 2]. Участие тимуса в иммунопатогенетических механизмах СД подтверждается возможностью препятствовать развитию СД или способствовать его ремиссии путем восстановления толерантности к антигенам β-клеток с помощью таких средств, как неонатальная тимэктомия, внутритимическая пересадка β-клеток, применение моноклональных антител против антигенов CD3 и CD8, введение популяций дендритных и Т-регуляторных клеток и др. [3]. Установлено, что одними из основных патогенетических факторов развития СД являются нарушение формирования центральной толерантности к антигенам поджелудочной железы (ПЖ) из-за изменения морфофункционального состояния антигенпредставляющих клеток (АПК) тимуса (их количества, экспрессии костимуляторных молекул СD80 и CD86 и др.), отсутствие достаточного представительства антигенов β-клеток в тимусе или нарушение продукции тимусом популяции естественных (натуральных) регуляторных Т-клеток CD4⁺CD25⁺ (Т_reg) [4, 5].

В свою очередь одной из актуальных проблем современной диабетологии является гестационный диабет (ГД) — нарушение углеводного обмена, впервые выявленное или возникшее во время беременности и приводящее к гипергликемии разной степени выраженности. ГД является основной причиной макросомии плода (частота родов крупным плодом варьирует в пределах 8—18,5%) и одним из факторов риска развития в дальнейшем у потомства СД [6]. Внутриутробная гипергликемия, развивающаяся при ГД, способна вызвать нарушения морфогенеза тимуса и дисфункцию его лимфоидного и эпителиального компонентов, что может привести к нарушению формирования центральной толерантности к инсулину как фактору риска развития СД у потомства. Тем не менее в настоящий момент практически отсутствуют данные об особенностях морфофункционального состояния тимуса у потомства, рожденного от матерей, перенесших ГД. Поэтому целью настоящего исследования было изучение особенностей формирования центральной толерантности к антигенам ПЖ, выяснение функционального состояния АПК и клеток Т_reg тимуса, а также определение особенностей течения процессов апоптоза тимоцитов у потомства крыс с экспериментальным гестационным диабетом (ЭГД).

ЭГД моделировали по методике, разработанной на кафедре патофизиологии ЗГМУ [7]. Самкам крыс линии Вистар на 15-е сутки беременности однократно внутрибрюшинно вводили стрептозотоцин (SIGMA, США) в дозе 45 мг/кг, разведенного ex tempore в 1 мл 0,1 М цитратного буфера (рН 4,5). На 3-й день у самок измеряли уровень глюкозы в крови и в дальнейший эксперимент отбирали только тех крыс, уровень глюкозы у которых составлял не менее 8 ммоль/л. Новорожденных крысят от самок с ЭГД отсаживали через месяц после рождения, разделив по полу. Исследования проведены на месячных (n=9) и 3-месячных (n=9) самцах — потомках крыс с ЭГД, в качестве контрольной группы использовали самцов того же возраста, содержавшихся в тех же условиях, рожденных от интактных крыс линии Вистар, которым на 15-е сутки беременности вводили внутрибрюшинно цитратный буфер. Животных декапитировали под наркозом и выделяли тимус, который фиксировали в растворе Буэна (18 ч) и после стандартной гистологической обработки заливали в парафин.

Экспрессирующие инсулин клетки тимуса (Ins+) выявляли иммуногистохимическим методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител к инсулину («Peninsula Laboratories Inc.», США). АПК тимуса определяли иммуногистохимическим методом прямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител к антигену МНС-II крысы («Beckman Coulter», США). Для выявления эпителиоретикулоцитов тимуса использовали моноклональные антитела к белкам цитокератинам (monoclonal Anti-Pan Cytoceratin — MAPC, клон PCK-26), являющимся специфическими маркерами эпителиальных клеток («Sigma Chemical», США). Клетки тимуса Т_reg выявляли иммуногистохимическим методом прямой иммунофлюоресценции, используя моноклональные антитела к одному из основных маркеров регуляторных клеток — CD25 (антитела производства «Caltag Laboratories», США). Влияние ЭГД на интенсивность экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и белков раннего ответа с-Fos в тимусе исследовали с помощью иммуногистохимического метода непрямой иммунофлюоресценции и моноклональных антител к Bcl-2 и с-Fos крысы («Sigma Chemical», США). На флуоресцентном микроскопе Axioskop («Zeiss», Германия) исследовали корковое и мозговое вещество тимуса, с помощью видеокамеры COHU-4922 (США) изображения вводили в систему цифрового анализа изображения VIDAS-386 («Kontron Elektronik», Германия). Структуру тимуса анализировали с помощью оригинального программного обеспечения, разработанного на основе макроязыка программирования VIDAS [8]. При этом изучаемыми параметрами были плотность иммунопозитивных клеток соответствующего класса на 1 мм2 тимуса. Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидазным методом, концентрацию инсулина в плазме — иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы «Peninsula Laboratories Inc.» (США). Вероятность различий в группах определяли t-статистикой Стьюдента с помощью пакета Statistica 6.0 (Stat-Soft, 2001), критический уровень значимости принимали равным 0,05.

Установлено (табл. 1),

У потомства крыс с ЭГД уже с 4-месячного возраста были отмечены изменения в тесте на толерантность к глюкозе — ТТГ (см. рисунок),

У 6-месячных животных — потомков самок с ЭГД при проведении ТТГ наблюдался диабетический тип гликемической кривой (см. рисунок), для которого характерно нарушение ранней и поздней фаз секреции инсулина с развитием инсулинорезистентности, о чем свидетельствует высокая гликемия в постабсорбционный период теста (после 90-й минуты).

Длительное время считалось, что β-клетки панкреатических островков являются единственным местом продукции инсулина в организме. Однако в последнее десятилетие была обнаружена внепанкреатическая экспрессия инсулина в тимусе, головном мозге, печени, жировой ткани, костном мозге, селезенке у человека и экспериментальных животных (мышей, крыс) в норме и при СД 1-го и 2-го типов, а также при искусственно поддерживаемой гипергликемии [9]. В 1998 г. были предприняты первые попытки установления клеточной принадлежности АПК тимуса, экспрессирующих инсулин [5]. Согласно полученным данным, такими являются дендритные клетки и макрофаги, имеющие костномозговое происхождение. Было выявлено клеточное распределение синтеза предшественников гормонов ПЖ: в дендритных клетках экспрессировался только препроинсулин, тогда как в макрофагах определяли экспрессию проглюкагона, просоматостатина и пропанкреатического полипептида, но не препроинсулина [5]. Строгими оказались последовательность и клеточная топография экспрессии генов семейства инсулина в строме тимуса: инсулиноподобный фактор роста 2-го типа — ИРФ-2 (эпителиальные клетки тимуса) — ИРФ-1 (тимические макрофаги) — инсулин (тимические эпителиальные клетки и/или дендритные клетки) [1]. С учетом того, что тимический инсулин наряду с другими островковыми антигенами (GAD, карбоксипептидаза H, проглюкагон, просоматостатин, пропанкреатический полипептид и др.) обеспечивает формирование центральной толерантности к антигенам β-клеток панкреатических островков, а нарушение его презентации АПК тимуса может являться одним из пусковых механизмов развития СД, представляет исключительный интерес изучение уровня экспрессии инсулина в тимусе и у потомства крыс с ЭГД. Изучение плотности популяции Ins+ клеток в корковом веществе тимуса у потомства крыс с ЭГД позволило выявить достоверное снижение их количества во все исследованные возрастные периоды по сравнению с таковыми у контрольных животных (табл. 2).

Для интегральной оценки функционального состояния и процессов дифференцировки клеточных элементов тимуса необходим учет АПК — весьма гетерогенной популяции клеток организма, которая в тимусе представлена главным образом В-лимфоцитами, макрофагами и дендритными (интердигитирующими) клетками [5]. Кроме того, молекулы МНС-II в тимусе могут экспрессировать и «непрофессиональные» АПК, к которым относятся прежде всего эпителиоретикулоциты коркового и мозгового вещества [10, 11]. В нормальных условиях на АПК тимуса осуществляется случайная презентация тканеспецифических аутоантигенов, уровень экспрессии которых контролируется аутоиммунным регулятором транскрипции AIRE [11]. Поэтому, возможно, что одним из механизмов, способствующих инициации СД, является нарушение презентации антигенов ПЖ в тимусе с помощью АПК и, как следствие этого — изменение негативной селекции и развития Т-клеточной толерантности к антигенам β-клеток панкреатических островков. При изучении плотности популяции АПК в корковом веществе тимуса у потомства крыс с ЭГД выявлено статистически значимое снижение их количества у месячного потомства крыс с ЭГД на 37% (р<0,05), у 3-месячного — на 47% (р<0,05) по сравнению с таковым в контроле, тогда как в мозговом веществе тимуса количество АПК статистически значимо уменьшалось (на 19%; р<0,05) только у месячного потомства крыс с ЭГД (см. табл. 2).

Значительная часть антигенов ПЖ презентируется эпителиоретикулоцитами коркового и мозгового вещества тимуса [1, 11]. Эпителиальный компонент тимуса отличается выраженной разнородностью и полиморфизмом [10]. В настоящее время существует большое число различных классификаций субпопуляций клеток эпителия тимуса; классификации основаны главным образом на происхождении, ультраструктурных и иммуногистохимических признаках этих клеток [12]. У месячного потомства крыс с ЭГД наблюдалось снижение суммарной плотности эпителиоретикулоцитов в коре тимуса на 46% (р<0,05) и в мозговом веществе на 43% (р<0,05) по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе животных. Сходная динамика обнаружена и у 3-месячного потомства крыс с ЭГД, у которого по сравнению с контролем суммарная плотность эпителиоретикулоцитов была снижена в корковом веществе на 26% (р<0,05), а в мозговом — на 32% (р<0,05) (см. табл. 2).

Проблема исследования молекулярных механизмов апоптоза и его роли в развитии аутоиммунных заболеваний, в том числе СД, стала в последние годы одной из самых трудных и актуальных в медицине [13]. Одним из основных регуляторов апоптоза является семейство генов bcl-2, которых в настоящее время насчитывает около 15 [14]. Представители семейства могут оказывать прямо противоположные эффекты на апоптоз. Так, члены этого семейства Bcl-2, Bcl-xL, ced-9, BHRF1, LMW5-HL оказывают антиапоптотические эффекты; Bax, Bcl-xS, Bad, Bak и Bik усиливают апоптоз, тогда как эффекты NR-13, A1, Mcl-1 неизвестны [13, 15]. Продукт гена bcl-2 — белок Bcl-2 — имеет молекулярную массу 26 кДа и является важнейшим репрессором апоптоза, который оказывает двойное действие: может функционировать и как ионный канал, и как адапторный белок [16]. Он экспрессируется на мембране митохондрий, в меньшей степени — на ядерной мембране и на поверхности клеток [13, 17]. Из клеток иммунной системы Bcl-2 экспрессируется на высоком уровне в незрелых предшественниках Т- и В-клеток, дубль-отрицательных тимоцитах, зрелых долгоживущих Т- и В-лимфоцитах, клетках памяти; слабая экспрессия или ее полное отсутствие наблюдается в период реаранжировки генов антигенраспознающих рецепторов, а также на эффекторных клетках [17, 18]. Нами обнаружено, что у месячного потомства крыс с ЭГД по сравнению с контрольной группой животных значительно возрастала суммарная плотность клеток Bcl-2+: в 3 раза (р<0,05) в корковом веществе и в 2,4 раза (р<0,05) в мозговом веществе; данная тенденция сохранялась и у 3-месячных животных (табл. 3).

Стимуляция покоящихся клеток ведет к переходу их к пролиферации, что сопровождается экспрессией генов «немедленного раннего ответа», среди которых особый интерес представляет протоонкоген c-fos [20]. Кратковременная активация экспрессии c-fos имеет большое значение для перехода клеток из фазы G0 в фазу G1 клеточного цикла [21]. Продукт гена c-fos (белок c-Fos) образует гетеродимер с белками семейства c-jun, формируя транскрипционный комплекс АР-1 [22]. Транскрипционный фактор АР-1 участвует в поддержании базального уровня экспрессии многих генов. Он является одной из главных мишеней для соединений, вызывающих пролиферацию или дифференцировку клеток [22]. Белок раннего ответа с-Fos является ядерным фосфопротеином с молекулярной массой 55 кДа и относится к семейству транскрипционных факторов, в которое кроме него входят Fos B, FRA-1 и FRA-2 [20]. с-Fos играет важную роль в процессах дифференцировки, пролиферации и гибели клеток. В последнее время выявлена тесная связь между интенсивностью экспрессии c-Fos и уровнем апоптотических процессов в тимусе. В частности, S. Okada (2003) показал возможность влияния с-Fos на NO-зависимый апоптоз, так как установлено, что он может выступать в роли негативного регулятора транскрипции индуцибельной NO-синтазы (iNOS) путем взаимодействия с ядерным фактором NF-IL6 (nuclear factor-IL6). [23]. Кроме того, была обнаружена возможность влияния с-Fos на апоптоз через систему рецепторов к α-фактору некроза опухоли (TNFα) [21]. Нами установлено, что у месячного потомства крыс с ЭГД по сравнению с контрольной группой животных суммарная плотность клеток c-Fos+ была снижена в корковом веществе тимуса на 41% (р<0,05) и в мозговом веществе — на 49% (р<0,05), тогда как у 3-месячного потомства количество клеток c-Fos+ снижалось только в мозговом веществе и оставалось на уровне контрольных значений в корковом веществе (см. табл. 3).

Важную роль в обеспечении иммунологической аутотолерантности и негативном контроле как патологических, так и физиологических иммунных реакций играет популяция естественных (натуральных) регуляторных Т-клеток CD4⁺CD25⁺ (Т_reg) [24—27]. Элиминация или инактивация этих клеток вызывает развитие тяжелых аутоиммунных заболеваний, а также приводит к усилению иммунного ответа на аллоантигены и опухолевые клетки [28]. По нашим данным, у месячного потомства крыс с ЭГД по сравнению с контрольной группой животных происходило снижение суммарной плотности клеток Т_reg в корковом веществе тимуса на 66% (р<0,05) и в мозговом веществе на 67% (р<0,05). У 3-месячного потомства крыс с ЭГД наблюдались разнонаправленные изменения: количество клеток Т_reg в корковом веществе возрастало на 72% (р<0,05), тогда как в мозговом веществе оставалось достоверно сниженным по сравнению с таковым в контроле (см. табл. 3).

Функциональная дефектность клеток CD4⁺CD25⁺ Т_reg обнаружена при многих аутоиммунных заболеваниях человека и моделирующей их экспериментальной патологии, прежде всего при СД 1-го типа. Так, у мышей-самок линии NOD, у которых спонтанно развивается заболевание, моделирующее СД 1-го типа, клетки Т_reg — продуценты TGFβ определяются в островковой ткани, но их содержание и функциональная активность снижаются с возрастом [29]. Введение клеток СD4⁺СD25⁺Т дозозависимо снижает частоту спонтанного развития СД у мышей линии NOD. Эти клетки отменяют индукцию СД при адаптивном переносе клеток СD4⁺СD25– от мышей NOD [30]. Пересадка мышам линии NOD с экспериментальным СД 1-го типа островковой ткани с одновременным инфицированием их вирусным вектором, несущим ген TGFβ, приводит к усилению инфильтрации. Пересадка островковой ткани с клетками СD4⁺СD25⁺Fохр3⁺ — к повышению приживаемости пересаженной ткани [4]. Дефект супрессорных функций клеток Т_reg был обнаружен и у пациентов с СД 1-го типа, что проявлялось снижением выработки интерлейкина-10 и изменением содержания внутриклеточного CTLA (сytotoxic T lymphocyte antigen 4) [2].

1. У потомства крыс с ЭГД обнаруживаются множественные иммунорегуляторные нарушения в тимусе: изменения процессов дифференцировки натуральных клеток Т_reg, снижение экспрессии белков раннего ответа c-Fos, снижение числа эпителиоретикулоцитов, антигенпредставляющих и инсулин-иммунопозитивных клеток, а также гиперэкспрессия антиапоптотического белка Bcl-2.

2. Обнаруженные изменения морфогенеза тимуса нарушают нормальное течение апоптоза, селекции тимоцитов и формирования центральной толерантности к антигенам ПЖ, что является одним из важнейших факторов риска, способствующих развитию аутоиммунной патологии, в том числе СД, у потомства.