Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Колесник Ю.М.

Кафедра патологической физиологии, ЦНИЛ Запорожского государственного медицинского университета

Камышный А.М.

Кафедра патологической физиологии, ЦНИЛ Запорожского государственного медицинского университета

Абрамов А.В.

Кафедра патологической физиологии, ЦНИЛ Запорожского государственного медицинского университета

Ганчева О.В.

Кафедра патологической физиологии, ЦНИЛ Запорожского государственного медицинского университета

Любомирская В.А.

Кафедра патологической физиологии, ЦНИЛ Запорожского государственного медицинского университета

Множественные иммунорегуляторные нарушения у потомства крыс с экспериментальным гестационным диабетом

Авторы:

Колесник Ю.М., Камышный А.М., Абрамов А.В., Ганчева О.В., Любомирская В.А.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2010;56(2): 36‑41

Просмотров: 248

Загрузок: 3

Как цитировать:

Колесник Ю.М., Камышный А.М., Абрамов А.В., Ганчева О.В., Любомирская В.А. Множественные иммунорегуляторные нарушения у потомства крыс с экспериментальным гестационным диабетом. Проблемы эндокринологии. 2010;56(2):36‑41.
Kolesnik IuM, Kamyshnyĭ AM, Abramov AV, Gancheva OV, Liubomirskaia VA. Multiple immunoregulatory disturbances in the progeny of rats with experimental gestational diabetes. Problemy Endokrinologii. 2010;56(2):36‑41. (In Russ.).

?>

За последние годы накоплено много данных, свидетельствующих о важной роли нарушения функционирования центрального органа иммуногенеза – тимуса в патогенезе сахарного диабета (СД) [1, 2]. Участие тимуса в иммунопатогенетических механизмах СД подтверждается возможностью препятствовать развитию СД или способствовать его ремиссии путем восстановления толерантности к антигенам β-клеток с помощью таких средств, как неонатальная тимэктомия, внутритимическая пересадка β-клеток, применение моноклональных антител против антигенов CD3 и CD8, введение популяций дендритных и Т-регуляторных клеток и др. [3]. Установлено, что одними из основных патогенетических факторов развития СД являются нарушение формирования центральной толерантности к антигенам поджелудочной железы (ПЖ) из-за изменения морфофункционального состояния антигенпредставляющих клеток (АПК) тимуса (их количества, экспрессии костимуляторных молекул СD80 и CD86 и др.), отсутствие достаточного представительства антигенов β-клеток в тимусе или нарушение продукции тимусом популяции естественных (натуральных) регуляторных Т-клеток CD4+CD25+reg) [4, 5].

В свою очередь одной из актуальных проблем современной диабетологии является гестационный диабет (ГД) — нарушение углеводного обмена, впервые выявленное или возникшее во время беременности и приводящее к гипергликемии разной степени выраженности. ГД является основной причиной макросомии плода (частота родов крупным плодом варьирует в пределах 8—18,5%) и одним из факторов риска развития в дальнейшем у потомства СД [6]. Внутриутробная гипергликемия, развивающаяся при ГД, способна вызвать нарушения морфогенеза тимуса и дисфункцию его лимфоидного и эпителиального компонентов, что может привести к нарушению формирования центральной толерантности к инсулину как фактору риска развития СД у потомства. Тем не менее в настоящий момент практически отсутствуют данные об особенностях морфофункционального состояния тимуса у потомства, рожденного от матерей, перенесших ГД. Поэтому целью настоящего исследования было изучение особенностей формирования центральной толерантности к антигенам ПЖ, выяснение функционального состояния АПК и клеток Тreg тимуса, а также определение особенностей течения процессов апоптоза тимоцитов у потомства крыс с экспериментальным гестационным диабетом (ЭГД).

Материал и методы

ЭГД моделировали по методике, разработанной на кафедре патофизиологии ЗГМУ [7]. Самкам крыс линии Вистар на 15-е сутки беременности однократно внутрибрюшинно вводили стрептозотоцин (SIGMA, США) в дозе 45 мг/кг, разведенного ex tempore в 1 мл 0,1 М цитратного буфера (рН 4,5). На 3-й день у самок измеряли уровень глюкозы в крови и в дальнейший эксперимент отбирали только тех крыс, уровень глюкозы у которых составлял не менее 8 ммоль/л. Новорожденных крысят от самок с ЭГД отсаживали через месяц после рождения, разделив по полу. Исследования проведены на месячных (n=9) и 3-месячных (n=9) самцах — потомках крыс с ЭГД, в качестве контрольной группы использовали самцов того же возраста, содержавшихся в тех же условиях, рожденных от интактных крыс линии Вистар, которым на 15-е сутки беременности вводили внутрибрюшинно цитратный буфер. Животных декапитировали под наркозом и выделяли тимус, который фиксировали в растворе Буэна (18 ч) и после стандартной гистологической обработки заливали в парафин.

Экспрессирующие инсулин клетки тимуса (Ins+) выявляли иммуногистохимическим методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител к инсулину («Peninsula Laboratories Inc.», США). АПК тимуса определяли иммуногистохимическим методом прямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител к антигену МНС-II крысы («Beckman Coulter», США). Для выявления эпителиоретикулоцитов тимуса использовали моноклональные антитела к белкам цитокератинам (monoclonal Anti-Pan Cytoceratin — MAPC, клон PCK-26), являющимся специфическими маркерами эпителиальных клеток («Sigma Chemical», США). Клетки тимуса Тreg выявляли иммуногистохимическим методом прямой иммунофлюоресценции, используя моноклональные антитела к одному из основных маркеров регуляторных клеток — CD25 (антитела производства «Caltag Laboratories», США). Влияние ЭГД на интенсивность экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и белков раннего ответа с-Fos в тимусе исследовали с помощью иммуногистохимического метода непрямой иммунофлюоресценции и моноклональных антител к Bcl-2 и с-Fos крысы («Sigma Chemical», США). На флуоресцентном микроскопе Axioskop («Zeiss», Германия) исследовали корковое и мозговое вещество тимуса, с помощью видеокамеры COHU-4922 (США) изображения вводили в систему цифрового анализа изображения VIDAS-386 («Kontron Elektronik», Германия). Структуру тимуса анализировали с помощью оригинального программного обеспечения, разработанного на основе макроязыка программирования VIDAS [8]. При этом изучаемыми параметрами были плотность иммунопозитивных клеток соответствующего класса на 1 мм2 тимуса. Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидазным методом, концентрацию инсулина в плазме — иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы «Peninsula Laboratories Inc.» (США). Вероятность различий в группах определяли t-статистикой Стьюдента с помощью пакета Statistica 6.0 (Stat-Soft, 2001), критический уровень значимости принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Установлено (табл. 1),

что у потомства крыс с ЭГД на протяжении первых 6 мес постнатального периода уровень глюкозы в крови натощак характеризовался относительной стабильностью и был в пределах нормы. В то же время наблюдалось статистически значимое увеличение концентрации инсулина в плазме и увеличение индекса НОМА, что может свидетельствовать о развитии инсулинорезистентности.

У потомства крыс с ЭГД уже с 4-месячного возраста были отмечены изменения в тесте на толерантность к глюкозе — ТТГ (см. рисунок),

Рисунок 1. Результаты теста на толерантность к глюкозе у 4- и 6-месячных самцов, потомков самок с ЭГД (M±t0,05*m).
что проявлялось отсроченностью появления пика гипергликемии в крови (не с 15-й, а с 30-й минуты); при этом пик концентрации глюкозы в крови был значимо ниже (p<0,05), чем в контрольной группе, а эугликемический уровень достигался не к 30-й, а только к 90-й минуте теста.

У 6-месячных животных — потомков самок с ЭГД при проведении ТТГ наблюдался диабетический тип гликемической кривой (см. рисунок), для которого характерно нарушение ранней и поздней фаз секреции инсулина с развитием инсулинорезистентности, о чем свидетельствует высокая гликемия в постабсорбционный период теста (после 90-й минуты).

Длительное время считалось, что β-клетки панкреатических островков являются единственным местом продукции инсулина в организме. Однако в последнее десятилетие была обнаружена внепанкреатическая экспрессия инсулина в тимусе, головном мозге, печени, жировой ткани, костном мозге, селезенке у человека и экспериментальных животных (мышей, крыс) в норме и при СД 1-го и 2-го типов, а также при искусственно поддерживаемой гипергликемии [9]. В 1998 г. были предприняты первые попытки установления клеточной принадлежности АПК тимуса, экспрессирующих инсулин [5]. Согласно полученным данным, такими являются дендритные клетки и макрофаги, имеющие костномозговое происхождение. Было выявлено клеточное распределение синтеза предшественников гормонов ПЖ: в дендритных клетках экспрессировался только препроинсулин, тогда как в макрофагах определяли экспрессию проглюкагона, просоматостатина и пропанкреатического полипептида, но не препроинсулина [5]. Строгими оказались последовательность и клеточная топография экспрессии генов семейства инсулина в строме тимуса: инсулиноподобный фактор роста 2-го типа — ИРФ-2 (эпителиальные клетки тимуса) — ИРФ-1 (тимические макрофаги) — инсулин (тимические эпителиальные клетки и/или дендритные клетки) [1]. С учетом того, что тимический инсулин наряду с другими островковыми антигенами (GAD, карбоксипептидаза H, проглюкагон, просоматостатин, пропанкреатический полипептид и др.) обеспечивает формирование центральной толерантности к антигенам β-клеток панкреатических островков, а нарушение его презентации АПК тимуса может являться одним из пусковых механизмов развития СД, представляет исключительный интерес изучение уровня экспрессии инсулина в тимусе и у потомства крыс с ЭГД. Изучение плотности популяции Ins+ клеток в корковом веществе тимуса у потомства крыс с ЭГД позволило выявить достоверное снижение их количества во все исследованные возрастные периоды по сравнению с таковыми у контрольных животных (табл. 2).

Так, у месячного потомства крыс с ЭГД плотность популяции клеток Ins+ снижалась на 48% (р<0,05), у 3-месячного — на 53% (р<0,05) по сравнению с таковой в контроле. Сходная динамика обнаруживалась и в мозговом веществе тимуса, где количество клеток Ins+ также достоверно снижалось на 58% (р<0,05) у месячного потомства и на 46% (р<0,05) у 3-месячного потомства крыс с ЭГД по сравнению с аналогичным показателем у контрольных животных (см. табл. 2).

Для интегральной оценки функционального состояния и процессов дифференцировки клеточных элементов тимуса необходим учет АПК — весьма гетерогенной популяции клеток организма, которая в тимусе представлена главным образом В-лимфоцитами, макрофагами и дендритными (интердигитирующими) клетками [5]. Кроме того, молекулы МНС-II в тимусе могут экспрессировать и «непрофессиональные» АПК, к которым относятся прежде всего эпителиоретикулоциты коркового и мозгового вещества [10, 11]. В нормальных условиях на АПК тимуса осуществляется случайная презентация тканеспецифических аутоантигенов, уровень экспрессии которых контролируется аутоиммунным регулятором транскрипции AIRE [11]. Поэтому, возможно, что одним из механизмов, способствующих инициации СД, является нарушение презентации антигенов ПЖ в тимусе с помощью АПК и, как следствие этого — изменение негативной селекции и развития Т-клеточной толерантности к антигенам β-клеток панкреатических островков. При изучении плотности популяции АПК в корковом веществе тимуса у потомства крыс с ЭГД выявлено статистически значимое снижение их количества у месячного потомства крыс с ЭГД на 37% (р<0,05), у 3-месячного — на 47% (р<0,05) по сравнению с таковым в контроле, тогда как в мозговом веществе тимуса количество АПК статистически значимо уменьшалось (на 19%; р<0,05) только у месячного потомства крыс с ЭГД (см. табл. 2).

Значительная часть антигенов ПЖ презентируется эпителиоретикулоцитами коркового и мозгового вещества тимуса [1, 11]. Эпителиальный компонент тимуса отличается выраженной разнородностью и полиморфизмом [10]. В настоящее время существует большое число различных классификаций субпопуляций клеток эпителия тимуса; классификации основаны главным образом на происхождении, ультраструктурных и иммуногистохимических признаках этих клеток [12]. У месячного потомства крыс с ЭГД наблюдалось снижение суммарной плотности эпителиоретикулоцитов в коре тимуса на 46% (р<0,05) и в мозговом веществе на 43% (р<0,05) по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе животных. Сходная динамика обнаружена и у 3-месячного потомства крыс с ЭГД, у которого по сравнению с контролем суммарная плотность эпителиоретикулоцитов была снижена в корковом веществе на 26% (р<0,05), а в мозговом — на 32% (р<0,05) (см. табл. 2).

Проблема исследования молекулярных механизмов апоптоза и его роли в развитии аутоиммунных заболеваний, в том числе СД, стала в последние годы одной из самых трудных и актуальных в медицине [13]. Одним из основных регуляторов апоптоза является семейство генов bcl-2, которых в настоящее время насчитывает около 15 [14]. Представители семейства могут оказывать прямо противоположные эффекты на апоптоз. Так, члены этого семейства Bcl-2, Bcl-xL, ced-9, BHRF1, LMW5-HL оказывают антиапоптотические эффекты; Bax, Bcl-xS, Bad, Bak и Bik усиливают апоптоз, тогда как эффекты NR-13, A1, Mcl-1 неизвестны [13, 15]. Продукт гена bcl-2 — белок Bcl-2 — имеет молекулярную массу 26 кДа и является важнейшим репрессором апоптоза, который оказывает двойное действие: может функционировать и как ионный канал, и как адапторный белок [16]. Он экспрессируется на мембране митохондрий, в меньшей степени — на ядерной мембране и на поверхности клеток [13, 17]. Из клеток иммунной системы Bcl-2 экспрессируется на высоком уровне в незрелых предшественниках Т- и В-клеток, дубль-отрицательных тимоцитах, зрелых долгоживущих Т- и В-лимфоцитах, клетках памяти; слабая экспрессия или ее полное отсутствие наблюдается в период реаранжировки генов антигенраспознающих рецепторов, а также на эффекторных клетках [17, 18]. Нами обнаружено, что у месячного потомства крыс с ЭГД по сравнению с контрольной группой животных значительно возрастала суммарная плотность клеток Bcl-2+: в 3 раза (р<0,05) в корковом веществе и в 2,4 раза (р<0,05) в мозговом веществе; данная тенденция сохранялась и у 3-месячных животных (табл. 3).

Полученные результаты можно охарактеризовать как развитие гиперэкспрессии Bcl-2 в результате ЭСД, что не противоречит имеющимся литературным данным, свидетельствующим о связи повышения экспрессии Bcl-2 и развития аутоиммунных процессов [16, 19]. Так, моделирование ослабления апоптоза путем трансфекции мышам гена bcl-2 в форме, предусматривающей его спонтанную экспрессию во всех или в определенных клетках, позволило выявить, что основным последствием гиперэкспрессии Bcl-2 является развитие системных аутоиммунных процессов (системной красной волчанки, ревматоидного артрита) [16].

Стимуляция покоящихся клеток ведет к переходу их к пролиферации, что сопровождается экспрессией генов «немедленного раннего ответа», среди которых особый интерес представляет протоонкоген c-fos [20]. Кратковременная активация экспрессии c-fos имеет большое значение для перехода клеток из фазы G0 в фазу G1 клеточного цикла [21]. Продукт гена c-fos (белок c-Fos) образует гетеродимер с белками семейства c-jun, формируя транскрипционный комплекс АР-1 [22]. Транскрипционный фактор АР-1 участвует в поддержании базального уровня экспрессии многих генов. Он является одной из главных мишеней для соединений, вызывающих пролиферацию или дифференцировку клеток [22]. Белок раннего ответа с-Fos является ядерным фосфопротеином с молекулярной массой 55 кДа и относится к семейству транскрипционных факторов, в которое кроме него входят Fos B, FRA-1 и FRA-2 [20]. с-Fos играет важную роль в процессах дифференцировки, пролиферации и гибели клеток. В последнее время выявлена тесная связь между интенсивностью экспрессии c-Fos и уровнем апоптотических процессов в тимусе. В частности, S. Okada (2003) показал возможность влияния с-Fos на NO-зависимый апоптоз, так как установлено, что он может выступать в роли негативного регулятора транскрипции индуцибельной NO-синтазы (iNOS) путем взаимодействия с ядерным фактором NF-IL6 (nuclear factor-IL6). [23]. Кроме того, была обнаружена возможность влияния с-Fos на апоптоз через систему рецепторов к α-фактору некроза опухоли (TNFα) [21]. Нами установлено, что у месячного потомства крыс с ЭГД по сравнению с контрольной группой животных суммарная плотность клеток c-Fos+ была снижена в корковом веществе тимуса на 41% (р<0,05) и в мозговом веществе — на 49% (р<0,05), тогда как у 3-месячного потомства количество клеток c-Fos+ снижалось только в мозговом веществе и оставалось на уровне контрольных значений в корковом веществе (см. табл. 3).

Важную роль в обеспечении иммунологической аутотолерантности и негативном контроле как патологических, так и физиологических иммунных реакций играет популяция естественных (натуральных) регуляторных Т-клеток CD4+CD25+reg) [24—27]. Элиминация или инактивация этих клеток вызывает развитие тяжелых аутоиммунных заболеваний, а также приводит к усилению иммунного ответа на аллоантигены и опухолевые клетки [28]. По нашим данным, у месячного потомства крыс с ЭГД по сравнению с контрольной группой животных происходило снижение суммарной плотности клеток Тreg в корковом веществе тимуса на 66% (р<0,05) и в мозговом веществе на 67% (р<0,05). У 3-месячного потомства крыс с ЭГД наблюдались разнонаправленные изменения: количество клеток Тreg в корковом веществе возрастало на 72% (р<0,05), тогда как в мозговом веществе оставалось достоверно сниженным по сравнению с таковым в контроле (см. табл. 3).

Функциональная дефектность клеток CD4+CD25+ Тreg обнаружена при многих аутоиммунных заболеваниях человека и моделирующей их экспериментальной патологии, прежде всего при СД 1-го типа. Так, у мышей-самок линии NOD, у которых спонтанно развивается заболевание, моделирующее СД 1-го типа, клетки Тreg — продуценты TGFβ определяются в островковой ткани, но их содержание и функциональная активность снижаются с возрастом [29]. Введение клеток СD4+СD25+Т дозозависимо снижает частоту спонтанного развития СД у мышей линии NOD. Эти клетки отменяют индукцию СД при адаптивном переносе клеток СD4+СD25– от мышей NOD [30]. Пересадка мышам линии NOD с экспериментальным СД 1-го типа островковой ткани с одновременным инфицированием их вирусным вектором, несущим ген TGFβ, приводит к усилению инфильтрации. Пересадка островковой ткани с клетками СD4+СD25+Fохр3+ — к повышению приживаемости пересаженной ткани [4]. Дефект супрессорных функций клеток Тreg был обнаружен и у пациентов с СД 1-го типа, что проявлялось снижением выработки интерлейкина-10 и изменением содержания внутриклеточного CTLA (сytotoxic T lymphocyte antigen 4) [2].

Выводы

1. У потомства крыс с ЭГД обнаруживаются множественные иммунорегуляторные нарушения в тимусе: изменения процессов дифференцировки натуральных клеток Тreg, снижение экспрессии белков раннего ответа c-Fos, снижение числа эпителиоретикулоцитов, антигенпредставляющих и инсулин-иммунопозитивных клеток, а также гиперэкспрессия антиапоптотического белка Bcl-2.

2. Обнаруженные изменения морфогенеза тимуса нарушают нормальное течение апоптоза, селекции тимоцитов и формирования центральной толерантности к антигенам ПЖ, что является одним из важнейших факторов риска, способствующих развитию аутоиммунной патологии, в том числе СД, у потомства.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail