Современная регенеративная медицина решает задачи восстановления поврежденной ткани с помощью активации эндогенных стволовых клеток или трансплантации клеточного материала. Одна из последних концепций этого направления базируется на применении региональных стволовых клеток тканевого происхождения с целью восстановления структурных и функциональных нарушений тканей/органов при лечении различных заболеваний [1—4]. В основном рассматриваются фибробластоподобные мезенхимальные стволовые клетки (СК), являющиеся одним из самых распространенных типов СК взрослого организма [5, 6]. В литературе [7, 8] встречаются различные названия этих клеток, наиболее часто: мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки или мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки. В статье будет использовано название «мезенхимальные стволовые клетки» (МСК). МСК являются уникальными регуляторами регенерации за счет выработки широкого спектра цитокинов и ростовых факторов. В настоящее время фундаментальные знания о МСК, впервые открытых в костном мозге в 1969 г. в лаборатории А.Я. Фриденштейна [9, 10], постоянно пополняются. Сегодня МСК найдены во всех органах и тканях организма человека [11—15].

Актуальность разработки клеточных продуктов для нужд эстетической медицины — косметологии, пластической и реконструктивной хирургии — продиктована спецификой этой отрасли, для которой регенерация тканей является одной из важнейших задач. Ведутся активное изучение, поиск различных тканевых источников и возможностей применения выделенных из них клеточных продуктов. Несмотря на практически повсеместное распространение МСК в организме, вопросы адекватного выбора оптимального тканевого источника для их получения остаются в центре внимания исследователей.

Одним из наиболее перспективных источников получения клеточных продуктов является жировая ткань (ЖТ). ЖТ выполняет ряд важных функций, включая метаболическую и эндокринную, а также содержит МСК. Для специалистов эстетической медицины ЖТ, которая может быть получена посредством липосакции, представляет особый интерес именно в качестве богатого источника МСК. С тех пор как в 2001—2002 гг. P. Zuk и соавт. [16, 17] впервые установили, что ЖТ человека является источником МСК, наблюдается экспоненциальный рост научных и клинических исследований их использования (рис. 1).

Причины, объясняющие интерес к МСК, выделенным из ЖТ (МСКЖТ), достаточно просты и понятны. Прежде всего ЖТ легкодоступна и может быть быстро и малотравматично получена с помощью хорошо зарекомендовавшего себя метода липосакции [18]. Во-вторых, существует возможность получения ЖТ в достаточном количестве для проведения всех необходимых манипуляций для большинства пациентов. В-третьих, концентрация МСКЖТ на 1 г ЖТ достаточно высока, в частности она более чем в 100 раз превышает количество МСК, выделенных из равного количества костного мозга [19]. В-четвертых, терапевтические дозы МСКЖТ могут быть получены ex tempоre без необходимости культивирования клеток в лаборатории, что существенно сокращает время получения клеточного продукта.

Согласно анализу данных CellTrials.org (https://celltrials.org/about), количество клинических исследований с применением препаратов на основе МСК каждый год увеличивается на 50% — за последние 5 лет (2013—2017 гг.) со 100 до 150 исследований в год (рис. 1).

ЖТ служит источником для получения клеточных продуктов, которые можно использовать и в пластической/реконструктивной хирургии (например, для улучшения приживаемости жирового трансплантата при проведении липофилинга), и в косметологии (для коррекции возрастных, рубцовых и других структурных изменений кожи), — стромально-васкулярной клеточной фракции (СВКФ), в том числе СКЖТ [16, 20, 21].

В ЖТ (рис. 2)

Выделить СВКФ из ЖТ можно двумя способами — ферментативным и неферментативным. В основе обоих лежит разрушение ЖТ с последующим ее центрифугированием для удаления зрелых адипоцитов и эритроцитов и получения очищенной СВКФ (рис. 3)

Первый способ предусматривает использование ферментов (коллагеназа I и II типов, трипсин, диспаза, блиндаза и их аналоги) для расщепления Ж.Т. Различают мануальный (открытый, используемый в специализированной лаборатории) и аппаратный (закрытый, автоматизированный или полуавтоматизированный) ферментативные способы. Следует отметить, что аппаратный метод имеет значительное преимущество перед мануальным: при нем используется закрытый способ выделения СВКФ, что минимизирует вероятность контаминации, он отличается большей стандартизацией процессинга, требует меньшей затраты времени, позволяет получить СВКФ непосредственно в операционной и применить ее ex tempore.

В основе второго, неферментативного способа (с разной степенью автоматизации) лежит воздействие на ЖТ механической силы, например с помощью вибрационного шейкера [20, 25—27].

Для получения СВКФ используют различные устройства, действие которых отличается по ряду параметров, таких как способ выделения СВКФ, тип и концентрация используемого фермента, тип механического воздействия, условия центрифугирования, методы лизиса эритроцитов, количество выделяемых клеток, длительность клеточного процессинга и др. [20, 26, 28, 29].

Большинство устройств рассчитано на получение из 1 мл липоаспирата в среднем от 500 тыс. до 1 млн ядросодержащих клеток с жизнеспособностью более 80% и содержанием СКЖТ в выделенной фракции от 1 до 15%. Время, затрачиваемое на выделение СВКФ, составляет от 15 до 120 мин [20, 25]. Использование ферментов, в частности коллагеназы, приводит к более интенсивному расщеплению внеклеточного матрикса ЖТ, а значит, к изоляции значительно большего количества ядросодержащих клеток, чем при применении неферментативного способа (до 1,3 млн клеток на 1 мл жира и до 240 тыс. клеток на 1 мл соответственно). Показано, что СКЖТ и перициты локализуются преимущественно вокруг малых и среднего размера сосудов ЖТ, однако в процессе механического воздействия (в отличие от ферментативного) большинство этих сосудов остается в нерасщепленных фрагментах соединительной ткани и элиминируется в ходе процессинга СВКФ [30—33]. Следовательно, выделенная неферментативным путем СВКФ будет отличаться значительно меньшим содержанием стволовых/прогениторных клеток [25]. Вместе с тем у механического способа выделения СВКФ есть и свои преимущества: отсутствует необходимость в ферментах, использование которых, как полагают, чревато риском негативного воздействия на ткани; значительно более низкая стоимость продукта; меньшее время, затрачиваемое на получение СВКФ (около 15 мин, в то время как при ферментативном способе — 30—120 мин) [25].

Из приборов, применяющихся при ферментативных способах, наиболее распространен Celution 800/CRS («Cytori Therapeutics, Inc.», США), более известный как Cytori Celution system. Это закрытое, полностью автоматизированное устройство, использующее смесь ферментов Celase. Celution 800/CRS способен обработать одномоментно до 360 мл ЖТ и выделить 240—360 тыс. ядросодержащих клеток на 1 мл липоаспирата, жизнеспособность которых составляет 84—93% [32, 33]. Celution 800/CRS имеет сертификат на применение в клинической практике в 28 странах Европы, в Австралии, Индии, Китае, Южной Корее и России (регистрационное удостоверение №ФСЗ 2012/12193 от 24.05.12).

Из механических способов представляет интерес способ, разработанный Р. Tonnard и соавт. [34], который получил название «nanofat». Он основан на механическом перемешивании липоаспирата до эмульгированного состояния с последующей фильтрацией. Nanofat представляет собой жировую эмульсию (не содержащую адипоцитов), из которой выделяют СВКФ посредством центрифугирования. Авторы предлагают использовать продукт как в виде жировой эмульсии, так и в виде СВКФ в разных областях медицины, в том числе и при коррекции морщин и рубцовых дефектов кожи. Благодаря простоте метода при соответствующей доказательной базе он может найти достойное применение. Исследования, посвященные nanofat, продолжаются, поскольку на сегодняшний день нет полной ясности как в отношении клеточного состава выделенной из эмульсии СВКФ, так и в отношении того, как влияет процесс эмульгирования жиров на составляющие СВКФ клетки [35].

Следует учитывать, что на состав СВКФ может оказывать влияние ряд факторов, таких как возраст пациента, методы выделения, фильтрации и другие особенности клеточного процессинга, вследствие чего получаемые образцы СВКФ могут сильно различаться. Поэтому очень важна стандартизация получаемого препарата, которая позволит добиться оптимального соотношения между клеточными популяциями, входящими в состав СВКФ, а соответственно и высокой клинической эффективности.

Согласно решению Международного общества технологий применения ЖТ (International Fat Applied Technology Society, 2004), СКЖТ принято называть содержащиеся в ней МСК (рис. 4)

СКЖТ, как и СК вообще, представляют собой не- или малодифференцированные клетки, способные к самообновлению и образованию нескольких типов дифференцированных потомков [11—13].

Это гетерогенная популяция негемопоэтических клеток-предшественников, происходящих из мезодермального ростка, которая способна к самообновлению и мультипотентной дифференцировке в направлении остеобластов, хондроцитов, адипоцитов, васкулярных эндотелиальных клеток [30]. В отличие от эмбриональных СК, образующихся на начальной стадии формирования организма (стадия бластоцисты), МСК появляются на более поздних стадиях. Они присутствуют в каждой ткани постнатального организма [5, 6, 36], локализуются преимущественно в периваскулярной зоне в специфических нишах, регулирующих их функционирование [37].

МСК секретируют широкий спектр про- и противовоспалительных цитокинов, хемокинов, факторов роста и простагландинов [38—42]. Следует отметить, что хотя МСКЖТ способны дифференцироваться в нескольких направлениях, в ЖТ этот процесс идет в адипо- и ангиогенном направлениях, за счет чего в ней и поддерживается адипо- и ангиогенез [22].

Таким образом, СКЖТ оказывают существенное влияние на репаративные процессы в зоне трансплантации, а именно:

— осуществляют неоангиогенез за счет дифференцировки СКЖТ в эндотелиальные клетки, активации эндотелиальных прогениторных клеток и продукции широкого спектра проангиогенных факторов (FGF, HGF, VEGF, IGF-I, TGF-β, GM-CSF, SDF-1, IL-6, -8, -17, NGF, TIMP-1 и TIMP-2, ангиогенин, ангиопоэтин-1), благодаря которым наблюдается выраженная активация процессов васкуляризации в области их присутствия [22, 42—45];

— осуществляют регенерацию адипоцитов за счет своей антиапоптической активности (факторы роста VEGF, GM-CSF, TGF-β, IGF-I, гликопротеин Stanniocalcin-1) и дифференцировки в адипоциты [40—42];

— влияют на модуляцию местных воспалительных реакций и оказывают иммуномодулирующий эффект за счет продукции факторов роста/цитоктнов (энзим indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO), простагландин PGE-2, факторы роста TGF-β и HGF, человеческий лейкоцитарный антиген HLA-G5) [16, 41, 42];

— оказывают антифибротический эффект (факторы роста HGF и bFGF) [24, 35, 46].

Получают СКЖТ in vitro из СВКФ или непосредственно из ЖТ путем культивирования (рис. 5)

В настоящее время Международным обществом жировой терапии и науки (International Federation for Adipose Therapeutics and Science — IFATS) совместно с Международным обществом клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy — ISCT) утверждено первичное руководство для исследователей, работающих с полученными из ЖТ клеточными продуктами [21]. Цель руководства — разработка международных стандартов, обеспечивающих стандартизацию СВКФ и возможность адекватного сравнительного анализа и воспроизведения результатов проводимых клинических исследований. В этом руководстве термином «стромальная васкулярная фракция» (СВКФ) обозначена популяция клеток, которые получают путем ферментативной обработки ЖТ и отделяют от зрелых адипоцитов с помощью дифференциального центрифугирования. Также определены минимальные критерии характеристики СВКФ: иммунофенотип — CD45–, CD235a–, CD31–, CD34+, CD13+, CD73+, CD90+, CD105+; in vitro-оценка жизнеспособности клеток и КОЕф (колониеобразующих единиц фибробластов); СКЖТ, входящие в состав СВКФ, in vitro должны сохранять маркеры, характерные для МСК, включая CD90+, CD73+, CD105+ и CD44+, оставаясь негативными для CD45– и CD31– — гемопоэтических и эндотелиальных клеток; оценка дифференцировочного потенциала (адипо-, остео-, хондрогенный) СКЖТ.

Одновременно с тем СКЖТ рассматриваются как адгезивные к пластику, ex vivo культивированные и последовательно пассированные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из СВКФ. Эти клетки должны обладать следующими минимальными морфофункциональными критериями, характерными для всех МСК-подобных популяций: мультилинейный дифференцировочный потенциал (адипо-, остео-, хондрогенный), экспрессия маркеров, характерных для стромальных клеток CD13+, CD73+, CD90+, и отсутствие экспрессии CD45– и CD11b–, гемопоэтических маркеров [21].

Разработка и утверждение критериев, характеризующих СВКФ и СКЖТ, играют важную роль в развитии регенеративной медицины, поскольку стандартизация клеточного материала является необходимым условием для успешного внедрения в практику результатов биомедицинских разработок, основанных на использовании СК.

Клеточные препараты, полученные из ЖТ, благодаря своим уникальным биологическим механизмам действия могут служить эффективным инструментом не только для контурной пластики и коррекции структурных изменений кожи, но и для реконструкции тканей при таких серьезных патологиях, как микросомия, липодистрофия, гемифасциальная атрофия, черепно-лицевые травмы. В настоящее время эта биомедицинская отрасль активно развивается, определяются главные стратегии и в косметологии, и в пластической/реконструктивной хирургии, уже доказаны безопасность и эффективность применения большинства из них. Но если в отношении дифференцированных (зрелых) клеток, к которым относятся, например, фибробласты кожи, вопрос стандартизации клеточного процессинга и оптимальной концентрации клеток уже решен (благодаря проведению полноценных мультицентровых рандомизированных контролируемых клинических исследований), то в области МСК (так же, как и СКЖТ) еще только предстоит это сделать.

Не вызывает сомнения, что СВКФ и СКЖТ представляют собой весьма перспективные клеточные продукты для применения в клинической практике. Однако, по мнению многих исследователей, на сегодняшний день СВКФ — более перспективный продукт, поскольку он является минимально манипулируемым клеточным препаратом, который благодаря наличию готовых приборов можно получить и использовать непосредственно в операционной. СВКФ является богатым источником стволовых (как мезенхимальных, так и эндотелиальных/гладкомышечных) клеток благодаря продукции множества факторов роста/цитокинов, которые обладают высокими регенеративными возможностями. Особенно важные из них — неоангиогенез и иммуномодуляция. В связи с этим применение СВКФ может быть эффективным как в эстетических целях (при коррекции возрастных и рубцовых дефектов кожи, алопециях), так и при таких серьезных нарушениях, как ишемия, некрозы, фиброз, где стандартные медицинские подходы малоэффективны. По мере того как регенеративная медицина становится более персонализированной, субпопуляции СВФК встанут в авангарде таргетной терапии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Орлова Ю.М. — https://orcid.org/0000-0003-0496-6008;

Устюгов А.Ю. — https://orcid.org/0000-0002-4598-1194;

Зорина А.И. — https://orcid.org/0000-0001-5016-3201;

Зорин В.Л. — https://orcid.org/0000-0001-9481-4061;

Поспелов А.Л. — https://orcid.org/0000-0003-1356-0683;

Мантурова Н.Е. — https://orcid.org/0000-0003-4281-1947

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Орлова Ю.М., Устюгов А.Ю., Зорина А.И., Зорин В.Л., Поспелов А.Л., Мантурова Н.Е. Клеточные препараты из жировой ткани. Пластическая хирургия и эстетическая медицина. 2019;3:-69. https://doi.org/10.17116/plast.hirurgia2019031

Автор, ответственный за переписку: Устюгов А.Ю. —
e-mail: Leikos@mail.ru