Особенности заживающего ишемизированного кожного дефекта после трансплантации в рану дермальных фибробластов при поддержке легочного сурфактанта

Распространенность венозных трофических язв у взрослого трудоспособного населения Российской Федерации составляет 1—2%. Венозные трофические язвы чаще регистрируются у женщин, в 0,3% случаев длительно не заживают и многократно рецидивируют [1, 2]. Язва представляет собой дефект тканей с малой тенденцией к заживлению, возникший на фоне нарушенной реактивности тканей вследствие внутренних причин, которые по интенсивности выходят за пределы адаптационных возможностей организма [1]. Наиболее часто в медицинской практике встречаются трофические язвы, причиной которых служит хроническая венозная недостаточность [2]. Частота развития венозных трофических язв с возрастом увеличивается и достигает максимума у лиц в возрасте 60 лет и более [3].

Несмотря на успехи современной медицины, в частности, флебологии, прослеживается явная тенденция к омоложению данного контингента больных, а радикальное устранение заболевания может быть достигнуто лишь у каждого десятого пациента [1]. В связи с достигнутыми в последние годы успехами в области клеточных технологий активное развитие получило новое направление в медицине — клеточная терапия. Среди множества типов клеток, способных оказывать клинический эффект, особый интерес вызывают дермальные фибробласты, которые представляют собой гетерогенную популяцию клеток мезенхимного ряда и играют ключевую роль в процессах регуляции клеточных взаимодействий и поддержании гомеостаза кожи. Кроме того, фибробласты принимают активное участие в биологических процессах, таких как воспаление, ангиогенез, а также фиброзирование тканей [4]. При этом они не проявляют онкогенные свойства [4].

Тканеинженерные кожные трансплантаты с дермальными фибробластами доказали свою эффективность при закрытии глубоких кожных ран, в том числе при нарушении венозного кровообращения [5]. Микросредой для дермальных фибробластов может являться легочный сурфактант, который секретируется клетками альвеолярного эпителия II типа и, благодаря своим свойствам, защищает дистальную часть легкого от вредных частиц и микроорганизмов [6—8]. Показано, что применение легочного сурфактанта при кожных ранах дает высокий заживляющий эффект [9]. Сведения о сочетанном воздействии дермальных фибробластов и сурфактанта в доступной литературе практически отсутствуют, что свидетельствует об актуальности исследования.

Цель исследования: изучить морфологические особенности биоптатов заживающего ишемизированного кожного дефекта у мышей после трансплантации тканеинженерной конструкции из легочного сурфактанта и дермальных фибробластов.

В работе использованы 145 белых лабораторных мышей линии C57/B1, достигшие возраста 4—6 мес. Размер выборки (n=145) рассчитан с помощью on-line-калькулятора размера выборки Sample Size Calculator при заданном уровне достоверности 95% и допустимой погрешности 5%. Все животные были разделены на контрольную и экспериментальную группы (табл. 1) [10, 11]. Эксперименты проводили со следованием всем принципам гуманности, содержащихся в директиве Европейского Сообщества (86/609/ЕС), и в соответствии с «Правилами выполнения работ с привлечением экспериментальных животных». Исследования проводили на основании заключения комитета по этике ордена Трудового Красного Знамени медицинского института им. С.И. Георгиевского» (протокол заседания комитета по этике №5 от 23.04.2024).

Таблица 1. Распределение мышей (n=145) по срокам забора материала в контрольной и экспериментальной группах

Модельную рану формировали по методике, предложенной Ю.Г. Барановским и соавт. (2016) [12]. Экспериментальная группа (75 особей) объединяла мышей, которым на модельную рану во время операции трансплантировали 2D-конструкцию, состоящую из поверхностно нанесенного легочного сурфактанта, а края и дно раны однократно обкалывали 0,4 мл взвеси аллофибробластов второго или третьего пассажей в ростовой среде DMEM F12 (Lonza) в количестве 1,33 млн клеток.

Коммерчески доступные препараты легочных сурфактантов содержат липофильную фракцию после лаважа или экстракции из легких животных [13]. У мышей экспериментальной группы использовали раствор препарата природного сурфактанта — порактант альфа (Куросульф, Curosulf, «Chiesi Farmaceutici», Италия). Он представляет собой сложный комплекс, включающий гидрофобные низкомолекулярные протеины, полярные фосфолипиды и полисахариды, полученные из измельченных легких телят и поросят. Указанный фармакологический препарат зарегистрирован Фармкомитетом Российской Федерации. Сверху рану закрывали асептической повязкой «Воскопран» с левомиколем.

По истечении 4, 7, 10, 12 и 15 сут восстанавливающийся ишемизированный дефект кожного покрова иссекали при повторном оперативном вмешательстве после внутрибрюшинного введения 0,3—0,4 мл 2,5% раствора авертина. Биоптат помещали в 10% раствор забуференного нейтрального формалина. По общепринятой методике материал пропитывали парафином и готовили срезы толщиной 3—4 мкм. Обзорная окраска срезов была проведена гематоксилином Майера и эозином. Толщину эпидермиса, площадь, занимаемую коллагеновыми волокнами и микрососудами в грануляционной ткани биоптатов, измеряли с помощью программы ImageJ при общем увеличении в 400 раз светового микроскопа Олимпус CX40 по 50 измерений на срез. Удельную площадь коллагеновых волокон и кровеносных сосудов рассчитывали в процентах от площади грануляционной ткани в срезах. Сравнения статистических выборок толщины эпидермиса, площади коллагеновых волокон и кровеносных сосудов выполняли в процентах по отношению к контрольной группе в каждом сроке заживления или по отношению к каждому показателю в биоптате предыдущего срока, используя программу MS Office Excel 2007 и Statistica 10,0 Enterprise («StatSoft Inc.», США). Нормальность распределения данных проверяли с помощью критерия Шапиро—Уилка [14]. Проводили попарное сравнение контрольной и экспериментальной групп крыс через 4, 7, 10, 12 и 15 дней. Поскольку распределение данных отличалось от нормального, использовали критерий Манна—Уитни (U-критерий) со степенью достоверности различий p≤0,05 для попарных сравнений выборок. Все термины приведены в соответствии со вторым изданием Международной анатомической терминологии и ее русского эквивалента [15].

На 4-й день после моделирования раны в контрольной группе ее поверхность закрыта толстым струпом, состоящим из фибрина и клеток лейкоцитарного ряда, часть из которых деструктурирована. Эпидермис отсутствует. В экспериментальной группе после трансплантации в рану сурфактанта в сочетании с культивированными дермальными аллофибробластами ее поверхность покрыта эпителием, толщина которого составляет в среднем 10,01±0,01 мкм (табл. 2). В центральных отделах ишемизированной раны имеется один ряд призматических клеток, а по периферии — 2—3 ряда эпителиоцитов. В срезах биоптатов ран основу составляет небольшое количество грануляционной ткани, соответствующей по своему строению второй пролиферативной стадии раневого процесса, и белая жировая ткань из подкожной жировой клетчатки. Грануляционная ткань на этой стадии раневого процесса преимущественно состоит из коллагеновых волокон, между которыми много отечной жидкости и клеточных элементов. Коллагеновые волокна тонкие, прямые и, переплетаясь, образуют крупнопетлистый ретикулум. Площадь коллагеновых волокон в эксперименте составляет в среднем 10,01±0,01% от площади дермы (см. табл. 2). Кровеносные капилляры отсутствуют в грануляционной ткани контроля и редко встречаются в грануляционной ткани экспериментальной группы. Площадь, занимаемая ими в контроле, в среднем составляет 0,22±0,01% от площади дермы биоптатов (см. табл. 2).

Таблица 2. Толщина эпидермиса, площадь коллагеновых волокон и кровеносных сосудов в биоптатах заживающей модельной раны у мышей контрольной и экспериментальной групп

Примечание. *— различия достоверны по сравнению с контролем (p≤0,05); ** —различия Достоверны по сравнению с предыдущим этапом исследования (p≤0,05).

На 7-й день послеоперационного периода поверхность раны полностью эпителизирована в биоптатах обеих групп. Толщина эпидермиса после трансплантации тканеинженерной конструкции на 53,36% больше, чем в контроле. Как прослеживается из рис. 1, а, в данном сроке регенерации раны впервые регистрируется наличие однослойного эпителия на поверхности биоптатов, в центральной области биоптатов эпидермис имеет один ряд призматических клеток, а по периферии — 2—3 ряда. В экспериментальной группе эпидермис состоит из 4—5 рядов эпидермоцитов. По сравнению с 4-ми сутками послеоперационного периода толщина эпидермиса в экспериментальной группе достоверно увеличилась на 78,48% за счет увеличения рядов клеток над базальным рядом эпидермоцитов (рис. 1, б).

Рис. 1. Срез биоптатов ишемизированной раны кожи на 7-й день после операции по моделированию кожного дефекта. Окраска гематоксилином и эозином.

а — контрольная группа (×200); б — экспериментальная группа (×150). 1 — эпидермис; 2 — грануляционная ткань; 3 — коллагеновые волокна; 4 — кровеносные капилляры.

Грануляционная ткань в биоптатах обеих групп демонстрирует признаки второй стадии раневого процесса и выполняет весь объем биоптатов под эпидермисом. Площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами, в контроле составила в среднем 21,22±0,01% от площади дермы биоптатов, а в эксперименте расширилась на 33,88%, составляя 27,45±0,01% (см. табл. 2). Грануляционная ткань в экспериментальной группе статистически достоверно богаче коллагеновыми волокнами на 22,70%. Коллагеновые волокна ретикулярной ткани в биоптатах обеих групп, переплетаясь, образуют мелкопетлистую сеть. Эта сеть обильно васкуляризирована и насыщена клетками грануляционной ткани.

На 10-й день после моделирования раны у мышей экспериментальной группы происходит отделение силиконового кольца вокруг раны. У животных обеих групп поверхность биоптатов закрыта эпидермисом, толщина которого на 22,13% толще в экспериментальной группе. Базальный слой призматических клеток в биоптатах экспериментальной группы прилегает к хорошо контурирующейся базальной мембране. Грануляционная ткань биоптатов из обеих групп находится на второй пролиферативной стадии раневого процесса.

На 12-й день у мышей контрольной и экспериментальной групп модельная рана свободна от ограничивающего кольца. В контрольной группе отпадение его произошло на 12,42±0,01 сутки после операции по моделированию ишемизированной раны. Толщина эпидермиса за прошедшие 2 сут достоверно увеличилась в контрольной группе на 25,56%, а после трансплантации сурфактанта с дермальными фибробластами — на 21,96% (см. табл. 2) благодаря увеличению количества рядов эпителиальных клеток (рис. 2). В многослойном плоском ороговевающем эпителии эпидермиса содержатся базальный, шиповатый и зернистый слои, из которых наименее развит зернистый слой (см. рис. 2, б). В эпидермисе контрольной группы слои кератиноцитов четко не разграничены (рис. 2, а). В биоптатах экспериментальной группы в срезах видны закладки дериватов эпидермиса — шерстинки (см. рис. 2, б). Грануляционная ткань биоптатов по-прежнему находится на второй пролиферативной стадии раневого процесса.

Рис. 2. Срез биоптатов ишемизированной раны кожи на 12-й день после операции по моделированию кожного дефекта. Окраска гематоксилином и эозином.

а — контрольная группа (×200); б — экспериментальная группа (×100). 1 — эпидермис; 2 — грануляционная ткань; 3 — коллагеновые волокна; 4 — кровеносные капилляры; 5 — закладка шерстинок.

К 15-му дню послеоперационного периода поверхность биоптатов ишемизированного дефекта кожи полностью очистилась от струпа. Толщина эпидермиса в экспериментальной группе достоверно увеличилась на 21,46%, а в контроле — на 5,30% по сравнению с 12-м днем заживления (см. табл. 2). Толщина многослойного плоского частично ороговевающего эпителия эпидермиса в эксперименте на 32,29% достоверно больше, чем в контроле. Закладки шерстинок в биоптатах контрольной группы отсутствуют (см. рис. 2, а).

Грануляционная ткань в биоптатах на фоне трансплантации сурфактанта и аллофибробластов вступила в третью стадию раневого процесса, в то время как в контроле она имеет признаки второй стадии раневого процесса. В обеих группах коллагеновые волокна располагаются преимущественно параллельно друг другу и базальной мембране. Однако при сравнении их удельной площади в группах она на 7,43% меньше, чем в контроле, что свидетельствует о начале формирования менее грубого рубца. Васкуляризация грануляционной ткани биоптатов на 15-й день заживления раны в эксперименте на 5,79% меньше, чем в контроле, что характерно для стадии фиброзирования грануляционной ткани.

Заявленная тема исследования практически не освещена в отечественной литературе, вероятно, в связи с необходимостью наличия специализированной стерильной лаборатории, высококвалифицированного научного и вспомогательного персонала, прошедшего специализированное обучение, и высокой стоимости расходных материалов для выделения и культивирования дермальных фибробластов, являющихся регенеративно активными членами фибробластического дифферона, и создания на их основе тканеинженерных конструкций, которые возможно применить в клинической практике хирургов при лечении длительно незаживающих ишемизированных кожных дефектов, встречающихся у 1—2% населения старшего возраста и серьезно ухудшающих работоспособность и качество жизни населения.

Еще в 1954 г. К.К. Маклин [16] выдвинул гипотезу о некоторых наиболее важных функциях альвеолоцитов II типа или клеток альвеолярного эпителия II типа. С тех пор дальнейшие исследования первично культивируемых альвеолоцитов II типа, выделенных из различных видов животных, предоставили большой объем данных о выделении ими субстанции, получившей название «легочный сурфактант» [17]. Это привело к тому, что этим клеткам были приписаны важные биосинтетические, секреторные, метаболические, защитные и ремонтно-регенеративные функции, что свидетельствует о ключевой роли альвеолоцитов II типа в поддержании альвеолярного гомеостаза [18]. В дальнейшем немногочисленные исследования в основном зарубежных авторов продемонстрировали эффективность легочного сурфактанта в заживлении кожных ран путем активация дермальных фибробластов, секретирующих противовоспалительные цитокины [8, 16]. Компоненты сурфактанта SP-A и TGF-β влияют на репарацию эпидермиса, а также эндотелиальных клеток микрососудов, модулируя иммунный ответ [19, 20].

Наше исследование, касающееся поиска новых методов лечения длительно незаживающих ишимизированных кожных дефектов, обнаружило, что к 15-му дню после моделирования таких дефектов и трансплантации пульмонального сурфактанта в сочетании с культивированными дермальными аллофибробластами грануляционная ткань биоптатов вступает в третью стадию раневого процесса, в то время как в контроле продолжается вторая стадия раневого процесса. В течение всего изученного периода заживления толщина эпидермиса и удельная площадь коллагеновых волокон стабильно достоверно выше в экспериментальной группе. Под влиянием сурфактанта и дермальных аллоофибробластов максимальный прирост удельной площади коллагеновых волокон присутствует между 4-м и 7-м днями, а в контроле — только между 12-м и 15-м днями. Васкуляризация грануляционной ткани неуклонно достоверно возрастает в контрольной группе. В эксперименте удельная площадь кровеносных сосудов к 15-му дню снижается, что свидетельствует о фиброзировании грануляционной ткани биоптатов [18], которое не наблюдается без лечения.

Тканеинженерная конструкция из легочного сурфактанта с культивированными дермальными аллофибробластами представляется в качестве сильного кандидата для инновационного лечения хронических ишемизированных кожных дефектов и предотвращения чрезмерного рубцевания. Тканеинженерная конструкция оказалась безопасной и переносимой и на 13,69% ускоряет заживление хронических ишемизированных кожных дефектов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Дышлевая Л.М., Шаповалова Е.Ю.

Сбор и обработка материала — Дышлевая Л.М., Барановский Ю.Г., Харченко С.В., Барановский А.Г., Киреева Н.В., Канукоева Е.Ю.

Написание текста — Дышлевая Л.М., Барановский Ю.Г., Харченко С.В., Барановский А.Г.

Редактирование — Заднипряный И.В.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Dyishlevaya L.M., Shapovalova E.Yu.

Data collection and processing — Dyishlevaya L.M., Baranovskiy Yu.G., Harchenko S.V., Baranovskiy A.G., Kireeva N.V., Kanukoeva E.Yu.

Text writing — Dyishlevaya L.M., Baranovskiy Yu.G., Harchenko S.V., Baranovskiy A.G.

Editing — Zadnipryany I.V.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.